桑葉茯磚茶多糖的響應(yīng)面提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化降血脂作用

曾 橋,韋承伯,韓國鋒,韋文龍,蔣佳琪

(1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021;2.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院,陜西西安 710021;3.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院,陜西西安 710021;4.陜西樸道茯茶股份有限公司,陜西咸陽 713700)

桑葉為?？?Moraceae)植物桑(MorusalbaL.)的葉,又名鐵扇子[1],兼具食藥用價(jià)值,《中國藥典》記載其有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目等功效,用于風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花[2],由于食藥用歷史悠久,1993年原國家衛(wèi)生部將其列為藥食同源物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明,桑葉含有豐富的黃酮、多糖、氨基酸、生物堿等活性成分,具有降血糖[3]、降血脂[4]和膽固醇[5]、抗氧化[6]、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、改善消化系統(tǒng)[7]、抗腫瘤[8]等作用。桑葉在我國分布廣泛,產(chǎn)量巨大,除少量用于養(yǎng)蠶和藥用外,每年有大量的桑葉未得到有效的利用而浪費(fèi)。近年來,隨著人們對桑葉的研究及認(rèn)識的深入,以桑葉為原料開發(fā)具有一定保健功能的食品,從而提高其利用價(jià)值越來越受到人們的重視。

隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強(qiáng),具有保健功效和投資增值的傳統(tǒng)發(fā)酵茶受到了廣大消費(fèi)者的青睞,這其中尤其以茯磚茶的發(fā)展最為迅速,成為茶品市場上的新亮點(diǎn)。茯磚茶屬后發(fā)酵茶,是所有茶類中加工工藝最復(fù)雜、生產(chǎn)加工周期最長、工藝最獨(dú)特的黑茶類產(chǎn)品[9]。茯磚茶內(nèi)質(zhì)金花普茂,菌香濃郁,開湯后湯色紅濃,滋味醇和,香氣純正[10],具有消食健胃、降脂減肥、降血糖、抗腫瘤、保肝護(hù)肝等功效。桑葉屬于可再生資源、產(chǎn)量大、價(jià)格低廉,加之有制茶的歷史,是制作茯磚茶的理想原料。通過將桑葉發(fā)酵制作成桑葉茯磚茶,對于提高桑葉利用率,增加產(chǎn)品附加值,促進(jìn)農(nóng)民增收具有重要意義。

本文前期以桑葉為原料,經(jīng)采摘、干燥、渥堆、汽蒸、成型、發(fā)花、陳化等工藝制作而成桑葉茯磚茶的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對桑葉茯磚茶多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究,并考察桑葉茯磚茶多糖的抗氧化活性及降血脂作用,從而為桑葉茯磚茶的飲用以及進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉茯磚茶 所用原料桑葉為霜桑葉,2016年11～12月采摘于陜西漢中勉縣,經(jīng)陜西科技大學(xué)藥學(xué)系鑒定為?？浦参锷?MorusalbaL.)的葉,后在陜西樸道茯茶股份有限公司制作而成;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%;胃蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司,BR,1∶250;胰蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司,USP級,1∶30000;濃硫酸、濃鹽酸、水楊酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉、30%雙氧水 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;苯酚、過硫酸鉀、無水乙醇、鐵氰化鉀、抗壞血酸(VC) 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;硫酸亞鐵 廣東光華科技股份有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、ABTS二胺鹽、甘氨膽酸鹽、?；悄懰猁} 上海源葉生物科技有限公司。

TU-1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FA1004N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DZ-2BC型真空干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;GZX-9246MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;TD5A大容量低速離心機(jī) 長沙英泰儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑葉茯磚茶預(yù)處理 取桑葉茯磚茶1塊(500 g),將其掰開捏碎,置于50 ℃真空干燥箱中干燥至恒重后,粉碎過60目篩,得桑葉茯磚茶粉末備用。

1.2.2 桑葉茯磚茶多糖水提工藝流程 精密稱定桑葉茯磚茶粉末→熱水提取→冷卻至室溫→離心(4000 r/min)15 min→取上清液→抽濾→得多糖提取液。

1.2.3 多糖含量的測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取干燥至恒重葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用蒸餾水溶解定容至100 mL,得0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液備用。精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,加蒸餾水稀釋定容,搖勻,得濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液。精密量取各濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液2 mL至具塞錐形瓶中,加入5%苯酚溶液1 mL,搖勻,迅速加入濃硫酸5 mL,搖勻,于沸水浴中水解15 min,取出,冷卻至室溫,待測。另取蒸餾水2 mL按上述條件處理作空白對照。于490 nm處測吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(X)為橫坐標(biāo),吸光度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 桑葉茯磚茶多糖含量的測定 精密稱取1.2.1中的桑葉茯磚茶粉末2 g,按1.2.2中的方法進(jìn)行操作獲得桑葉茯磚茶多糖提取液,用蒸餾水定容至100 mL,進(jìn)一步精密吸取1.0 mL至50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容;進(jìn)一步地精密吸取2 mL至具塞錐形瓶中,按1.2.3.1“加入5%苯酚溶液1 mL……待測”操作,另取蒸餾水2 mL按上述條件處理作空白對照。于490 nm處測吸光度。將所測吸光度值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中,計(jì)算得樣品溶液中多糖的濃度,按稀釋倍數(shù)計(jì)算得多糖含量。

1.2.3.3 桑葉茯磚茶多糖得率的計(jì)算

多糖得率(%)=[(Y×V×D)/(B×106)]×100

式中:Y為多糖濃度(μg/mL);V為樣品溶液體積(mL);D為稀釋倍數(shù);B為原料重量(g);106為質(zhì)量換算系數(shù)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以桑葉茯磚茶多糖得率為考察指標(biāo),分別考察提取溫度、提取時(shí)間、液料比以及提取次數(shù)對得率的影響。

1.2.4.1 提取溫度對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 精密稱取桑葉茯磚茶試樣2 g,在提取次數(shù)為1次,提取時(shí)間為2 h,液料比為20 mL/g下,分別考察提取溫度40、50、60、70、80、90 ℃對桑葉茯磚茶多糖得率的影響。

1.2.4.2 提取時(shí)間對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 精密稱取桑葉茯磚茶試樣2 g,在提取次數(shù)為1次,提取溫度為80 ℃,液料比為20 mL/g下,分別考察提取時(shí)間為0.5、1、1.5、2、2.5 h對桑葉茯磚茶多糖得率的影響。

1.2.4.3 液料比對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 精密稱取桑葉茯磚茶試樣2 g,在提取次數(shù)為1次,提取時(shí)間為2 h,提取溫度為80 ℃下,分別考察液料比為8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1、32∶1 mL/g對桑葉茯磚茶多糖得率的影響。

1.2.4.4 提取次數(shù)對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 精密稱取桑葉茯磚茶試樣2 g,在提取時(shí)間為2 h,液料比為20 mL/g,提取溫度為80 ℃下,分別考察提取次數(shù)為1、2、3次對桑葉茯磚茶多糖得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以提取溫度,提取時(shí)間以及液料比為自變量,利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),其實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.6 體外抗氧化活性研究

1.2.6.1 DPPH自由基清除活性測定 參照文獻(xiàn)[11]稍加改進(jìn)。稱取一定量DPPH粉末,用無水乙醇配制成濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液。用蒸餾水將桑葉茯磚茶多糖母液稀釋成8、16、24、32、40、48、56、64、72、80 μg/mL的濃度梯度。取10支潔凈具塞試管,分別依次加入DPPH溶液2 mL,各濃度梯度桑葉茯磚茶多糖溶液2 mL,劇烈振搖,室溫放置30 min,以蒸餾水調(diào)零,于517 nm處測吸光度記為A樣品。用蒸餾水代替DPPH溶液按上述方法處理測定吸光度記為A對照,以蒸餾水代替桑葉茯磚茶多糖提取液按上述方法處理測定吸光度記為A空白。同時(shí),以VC為陽性對照。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100

1.2.6.2 ABTS+·清除活性測定 參照文獻(xiàn)[12]和[13]稍加改進(jìn)。將8.1 mmol/L ABTS溶液與3.2 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合,暗處放置16 h,使用時(shí)用無水乙醇稀釋至其在734 nm 波長處A為0.70左右。分別取質(zhì)量濃度為10、30、50、70、90、110、130 μg/mL桑葉茯磚茶多糖提取液1 mL置于具塞試管中,加入4 mL ABTS+·溶液,室溫避光反應(yīng)6 min,在734 nm下,測其吸光度記為A樣品;以1 mL蒸餾水代替桑葉茯磚茶多糖溶液為空白組,測吸光度記為A空白,以上測定時(shí)均以蒸餾水調(diào)零。同時(shí),以VC為陽性對照。按下式計(jì)算ABTS+·清除率:

ABTS+·清除率(%)=(1-A樣品/A空白)×100

1.2.6.3 ·OH清除活性測定 參照文獻(xiàn)[14]稍加改進(jìn)。于不同試管中分別加入質(zhì)量濃度為0.175、0.35……1.75、1.925 mg/mL桑葉茯磚茶多糖溶液2 mL,每支試管依次加6 mmol/L 的FeSO4溶液2 mL,6 mmol/L的H2O2溶液2 mL,搖勻,靜置10 min,進(jìn)一步加入6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL 搖勻,于37 ℃水浴30 min,0.45 μm微孔濾膜濾過,以蒸餾水調(diào)零,于510 nm 測吸光值,記為A樣品。以蒸餾水代替桑葉茯磚茶多糖提取液按上述方法測定吸光度,記為A空白;用蒸餾水代替水楊酸按上述方法測定吸光度,記為A對照。同時(shí),以VC為陽性對照,按下式計(jì)算·OH清除率:

·OH清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100

1.2.7 降血脂作用研究

1.2.7.1 繪制膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線 參照文獻(xiàn)[15]的方法,略作修改,分別繪制甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}標(biāo)準(zhǔn)曲線。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(甘氨膽酸鹽0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30 mmol/L,?；悄懰猁}0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mmol/L)2 mL分別置于不同具塞試管中,分別加入6 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的H2SO4溶液于70 ℃水浴20 min,取出冰浴5 min,在387 nm波長處測定吸光度。以膽酸鹽含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)分別繪得甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7.2 膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[15]的方法,略作修改,移取質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL桑葉茯磚茶多糖溶液3 mL于100 mL具塞三角瓶中,每個三角瓶分別加入10 mg/mL胃蛋白酶溶液3 mL和0.01 mol/L的HCl溶液1 mL,在37 ℃下恒溫水浴振蕩消化1 h(模擬胃消化環(huán)境)。隨后以0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.3,加入10 mg/mL胰蛋白酶溶液4 mL,在37 ℃下恒溫水浴振蕩消化1 h(模擬腸道環(huán)境)。每個樣品中加入0.4 mmol/L甘氨膽酸鹽4 mL或0.5 mmol/L?；悄懰猁}4 mL,繼續(xù)恒溫水浴振蕩1 h,于4000 r/min離心20 min,取上清液,于387 nm處測定吸光度值,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算剩余甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}含量,所加入甘氨膽酸鹽或?；悄懰猁}總量減去剩余量所得差值與總量的比值即為結(jié)合率,以百分比表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次回歸分析及方差分析,其余實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用Graph Pad Prism軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.2.3.1項(xiàng)下規(guī)定所繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:y=0.0671x+0.0021,相關(guān)系數(shù)R2=0.9998,線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 單因素對桑葉茯磚茶多糖得率的影響

2.2.1 提取溫度對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 如圖2所示,提取溫度在40～50 ℃區(qū)間內(nèi)時(shí),桑葉茯磚茶多糖得率隨溫度的升高而增大,在50 ℃時(shí),得率最大,這是由于溫度越高,分子熱運(yùn)動越快,多糖溶出速度也就快,此外,溫度升高還能增加多糖溶解度。當(dāng)溫度超過50 ℃繼續(xù)升高時(shí),多糖得率則開始緩慢下降,這是因?yàn)檫^高的溫度會使得多糖部分水解從而造成得率下降。因此,合理的提取溫度為50 ℃,這與文獻(xiàn)[16-17]研究的多糖最適提取溫度為70～80 ℃不同,可能的原因包括桑葉多糖和其他種類多糖在結(jié)構(gòu)上可能有區(qū)別,另外,茯磚茶制作過程中,由于高溫高濕的環(huán)境以及微生物的作用,可能導(dǎo)致糖的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[18],從而使得桑葉茯磚茶多糖的最佳提取溫度發(fā)生變化。

圖2 提取溫度對桑葉茯磚茶多糖得率的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

2.2.2 提取時(shí)間對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 由圖3可知,隨著提取時(shí)間的延長,桑葉茯磚茶多糖的得率先呈較快的增長,但是當(dāng)提取時(shí)間增加到1.5 h后,得率趨于平穩(wěn)甚至有緩慢下降趨勢。由于在初始階段,提取液中多糖濃度較低,因而溶出就較快,隨著提取時(shí)間的延長,提取液中多糖濃度逐漸增大,溶液逐步趨于飽和達(dá)到平衡狀態(tài),從而導(dǎo)致多糖溶出速率降低,因此,在后期延長提取時(shí)間,得率變化不大。綜合考慮能耗和節(jié)約時(shí)間等因素,選擇最佳提取時(shí)間為1.5 h。

圖3 提取時(shí)間對桑葉茯磚茶多糖得率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

2.2.3 液料比對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 由圖4可知,當(dāng)液料比小于12∶1 mL/g時(shí),桑葉茯磚茶多糖的得率隨著液料比的增加顯著增大,當(dāng)液料比大于12∶1 mL/g時(shí),多糖得率繼續(xù)緩慢增加,當(dāng)液料比大于16∶1 mL/g時(shí),多糖得率明顯降低,而當(dāng)液料比大于24 mL/g時(shí),桑葉茯磚茶多糖的得率則呈緩慢降低的趨勢。這可能是由于水量過大導(dǎo)致后續(xù)工序能耗增加,效率降低[19]。因此,桑葉茯磚茶多糖提取的最佳液料比確定為16∶1 mL/g。

圖4 液料比對桑葉茯磚茶多糖得率的影響Fig.4 The effect of liquid-solid ratio on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

2.2.4 提取次數(shù)對桑葉茯磚茶多糖得率的影響 由圖5可知,當(dāng)提取次數(shù)為1時(shí),桑葉茯磚茶多糖得率為11.10%,復(fù)提之后合并提取液,多糖得率為11.80%,得率變化極顯著(p<0.01),累計(jì)3次,多糖總得率為11.79%,得率變化不顯著(p>0.05)。雖然提取2次和1次相比,多糖得率變化極顯著(p<0.01),然而得率僅增加0.70%,若以最大得率11.80%為對照,提取1次即可獲得桑葉茯磚茶中94.07%的多糖,而增加提取次數(shù)不僅增加能耗,而且浪費(fèi)時(shí)間,從經(jīng)濟(jì)角度考慮,選擇提取1次為宜。

圖5 提取次數(shù)對桑葉茯磚茶多糖得率的影響Fig.5 The effect of extraction times on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick Tea

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化桑葉茯磚茶多糖提取工藝

2.3.1 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,確定以提取時(shí)間(A)、液料比(B)、提取溫度(C)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)三因素三水平共17組響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1,實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

2.3.2 回歸模型的建立及顯著性分析 以桑葉茯磚茶多糖得率為響應(yīng)值,對中心組合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析,獲得一個二次多項(xiàng)回歸方程:

Y=-71.46543+9.44485A+1.01308B+2.60778C-0.071741AB-0.015790AC+1.10438×10-3BC-2.34874A2-0.029232B2-0.025601C2

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析 采用Design Expert 8.0.6軟件繪制得響應(yīng)面曲面圖和等高線圖,如圖6～圖8,分別表示提取時(shí)間(A)和液料比(B)、提取時(shí)間(A)和提取溫度(C)、液料比(B)和提取溫度(C)的交互作用的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。

圖6 提取時(shí)間和液料比對桑葉茯磚茶多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of effects of extraction time and liquid-solid ratio on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

圖7 提取時(shí)間和提取溫度對桑葉茯磚茶多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of effects of extraction time and extraction temperature on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

圖8 提取溫度和液料比對桑葉茯磚茶多糖得率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of effects of extraction temperature and liquid-solid ratio on the polysaccharide extraction rate from mulberry leaves of fu brick tea

由圖6a可知,提取時(shí)間和液料比對桑葉茯磚茶多糖得率的影響較顯著,當(dāng)液料比一定時(shí),多糖得率隨提取時(shí)間的延長而增加,但是當(dāng)時(shí)間延長到一定程度后繼續(xù)延長時(shí)間,多糖得率則開始下降。圖6b等高線圖表明,在液料比和提取時(shí)間兩個因素中,時(shí)間對多糖得率的影響較液料比大。圖7a和圖8a響應(yīng)面圖表明,提取溫度和提取時(shí)間以及提取溫度和液料比對桑葉茯磚茶多糖得率的影響均較顯著,當(dāng)提取溫度一定時(shí),多糖得率隨提取時(shí)間的延長先增大后減小,隨液料比的增大先增大后減小。圖7b等高線圖表明,當(dāng)液料比一定時(shí),等高線圖呈圓形,表明提取時(shí)間和溫度交互作用不顯著。圖8b等高線圖表明,在液料比和提取溫度兩個因素中,溫度對多糖得率的影響較液料比大。

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對桑葉茯磚茶多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)模型預(yù)測,最佳提取條件為:提取時(shí)間1.59 h,液料比為16.34∶1 mL/g,提取溫度50.80 ℃,提取次數(shù)為1次,在此最佳工藝條件下,桑葉茯磚茶多糖得率為10.55%。考慮到實(shí)際操作可行性和方便性,對各個工藝參數(shù)稍作修改,即最佳工藝條件為:提取時(shí)間1.6 h,液料比16∶1 mL/g,提取溫度51 ℃,提取次數(shù)1次,平行進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),桑葉茯磚茶多糖得率為10.43%(SD=0.1123),與預(yù)測值相對誤差為1.14%,表明該最佳條件參數(shù)準(zhǔn)確、可行。

2.4 桑葉茯磚茶多糖體外抗氧化降血脂活性研究

2.4.1 體外抗氧化活性評價(jià)

2.4.1.1 DPPH自由基清除作用 從圖9可以看出,桑葉茯磚茶多糖對DPPH自由基具有較好的清除作用,其對DPPH自由基的清除效果隨濃度的增大而增大,當(dāng)桑葉茯磚茶多糖濃度大于56 μg/mL時(shí),繼續(xù)增大濃度,清除率增加緩慢。當(dāng)桑葉茯磚茶多糖濃度達(dá)到80 μg/mL時(shí),其對DPPH自由基的清除率達(dá)到84.35%。

圖9 不同質(zhì)量濃度桑葉茯磚茶多糖對DPPH自由基清除作用Fig.9 Scavenging activity of polysaccharide from mulberry leaves of fu brick tea at various concentrations against DPPH free radicals

2.4.1.2 ABTS+·清除作用 由圖10可以看出,桑葉茯磚茶多糖對ABTS+具有較好的清除作用,清除能力較VC弱。隨著桑葉茯磚茶多糖質(zhì)量濃度的增大,對ABTS+的清除率呈上升趨勢。當(dāng)質(zhì)量濃度大于70 μg/mL時(shí),繼續(xù)增大濃度,清除率增加緩慢,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到130 μg/mL時(shí),其對ABTS+的清除率可達(dá)72.30%。

圖10 不同質(zhì)量濃度桑葉茯磚茶多糖對ABTS+·清除作用Fig.10 Scavenging activity of polysaccharide from mulberry leaves of fu brick tea at various concentrations against ABTS+·

2.4.1.3 對·OH的清除作用 由圖11可知,隨著桑葉茯磚茶多糖和VC質(zhì)量濃度的上升,對·OH的清除率呈上升趨勢,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.875 mg/mL時(shí),桑葉茯磚茶多糖對·OH的清除率為56.10%,繼續(xù)增大濃度,清除能力增加緩慢。當(dāng)桑葉茯磚茶多糖濃度為1.75 mg/mL時(shí),對·OH的清除率為74.08%,此時(shí)清除能力達(dá)到最大值,繼續(xù)增大濃度,清除率不再增加。

圖11 不同質(zhì)量濃度桑葉茯磚茶多糖對·OH自由基清除作用Fig.11 Scavenging activity of polysaccharide from mulberry leaves of fu brick tea at various concentrations against ·OH

2.4.2 體外降血脂研究

2.4.2.1 甘氨膽酸鹽和牛磺膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線 甘氨膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=3.4857x+0.0047,R2=0.9995,線性關(guān)系良好。

牛磺膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=2.3696x+0.0051,R2=0.9992,線性關(guān)系良好。

2.4.2.2 桑葉茯磚茶多糖對膽酸鹽的結(jié)合能力 研究表明,膽汁酸能夠促進(jìn)脂類水解和吸收,若膽汁酸被其他物質(zhì)結(jié)合,則膳食中脂肪的吸收和利用便會得到抑制,從而達(dá)到降低血脂的目的。此外,一些食品成分能與膽汁酸結(jié)合,加速體內(nèi)膽固醇的分解,有效降低人體血清和肝中膽固醇的含量。正常人膽汁酸中90%為結(jié)合型膽汁酸,在體內(nèi)一般以鈉鹽形式存在,本研究選取甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c為結(jié)合對象,模擬人胃和腸道的環(huán)境,考察桑葉茯磚茶多糖對二者的結(jié)合能力,從而評價(jià)其降血脂效果[15,20]。

圖12 甘氨膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.12 Standard curve of glycine sodium cholate

圖13 ?；悄懰猁}標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.13 Standard curve of taurine sodium cholate

從圖14可以看出,桑葉茯磚茶多糖和甘氨膽酸鹽、牛磺膽酸鹽的結(jié)合量均隨多糖濃度的增大而增大。當(dāng)多糖濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí),桑葉茯磚茶多糖和?；悄懰猁}、甘氨膽酸鹽的結(jié)合率分別達(dá)到58.28%和39.95%,繼續(xù)增加濃度,結(jié)合率上升緩慢。當(dāng)濃度達(dá)到3.5 mg/mL時(shí),桑葉茯磚茶多糖和?；悄懰猁}、甘氨膽酸鹽的結(jié)合率分別達(dá)到59.96%和41.97%。桑葉茯磚茶多糖與牛磺膽酸鹽的結(jié)合量比甘氨膽酸鹽的結(jié)合量多,即桑葉茯磚茶多糖與?；悄懰猁}的結(jié)合能力更強(qiáng)。膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,桑葉茯磚茶多糖降血脂作用較好。

圖14 桑葉茯磚茶多糖對膽酸鹽結(jié)合能力Fig.14 The capacity of polysaccharide from mulberry leaves of fu brick tea to bind sodium cholate

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化了桑葉茯磚茶多糖的提取工藝,結(jié)果表明,最佳提取工藝為提取時(shí)間1.6 h,液料比16∶1 mL/g,提取溫度51 ℃,提取次數(shù)1次,在此最佳條件下,桑葉茯磚茶多糖得率為10.43%。體外抗氧化研究結(jié)果表明,桑葉茯磚茶多糖具有較好的抗氧化活性,其對DPPH自由基、ABTS+、·OH的清除能力隨多糖濃度的增大而增大,呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,桑葉茯磚茶多糖對甘氨膽酸鹽和?；悄懰猁}均有較強(qiáng)的結(jié)合能力,相較于甘氨膽酸鹽,桑葉茯磚茶多糖對牛磺膽酸鹽的結(jié)合能力較強(qiáng),說明桑葉茯磚茶多糖具有較好的降血脂作用。

本文所用桑葉為霜桑葉,即初霜后采收干燥而得,此階段的桑葉藥用價(jià)值最高。采用茯磚茶加工工藝制作而成的桑葉茯磚茶具有普通茯磚茶金花普茂,菌香濃郁,開湯后湯色紅濃,滋味醇和,香氣純正等特征[10],其品質(zhì)較普通桑葉茶大大提高。桑葉茯磚茶多糖含量豐富,具有較好的抗氧化活性和降血脂等保健作用,長期飲用對身體有益。采用水提法對所用桑葉原料中的多糖進(jìn)行提取,得率為12.83%,較桑葉茯磚茶多糖含量高,這可能是由于茯磚茶發(fā)酵過程中,冠突散囊菌部分利用了其中所含的多糖[21]。冠突散囊菌是茯磚茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌,其生長繁殖能產(chǎn)生大量有益的次生代謝產(chǎn)物,因而冠突散囊菌的數(shù)量是評價(jià)茯磚品質(zhì)的重要指標(biāo)。后續(xù)研究過程中,應(yīng)進(jìn)一步探討桑葉茯磚茶發(fā)酵過程中多糖的含量變化與冠突散囊菌生長繁殖的相關(guān)性,從而調(diào)控冠突散囊菌的生長代謝過程,這對于指導(dǎo)桑葉茯磚茶的生產(chǎn)具有重要作用,可以在保證產(chǎn)品品質(zhì)的同時(shí),盡量減少多糖的損失,以最大程度發(fā)揮桑葉茯磚茶的保健功效。