路曉青,江 念,黃志寶,馮 翔,張新欣,王文凱,*

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北荊州 434000;2.沙洋縣長(zhǎng)湖濕地自然保護(hù)區(qū)管理局,湖北荊門 448200;3.湖北民族學(xué)院,湖北恩施 445000)

當(dāng)今社會(huì)中人們的生活質(zhì)量得到很大的提升,生活節(jié)奏開(kāi)始加快,來(lái)自各方面的壓力也慢慢增大,長(zhǎng)此以往,人們便處于焦慮與疲勞狀態(tài)。感到焦慮與疲勞雖然對(duì)人體的傷害不是立即顯現(xiàn),但是這種亞健康狀態(tài)卻是不容忽視的。植物精油作為天然香料從古至今一直在沿用,其安全性和實(shí)用性可以得到保證[1-3]。目前關(guān)于精油藥理作用的文獻(xiàn)報(bào)道越來(lái)越多,現(xiàn)有的研究表明，精油有潛力作為抗氧化劑、鎮(zhèn)痛劑、抑菌藥物、抗疲勞藥物應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)[4-6]。我國(guó)植物資源豐富,其中許多植物精油具有愉悅身心、緩解疲勞、調(diào)節(jié)情緒、提高免疫力等功能,這類植物精油可作為良好的天然香料進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用[7]。

竹葉椒果為蕓香科花椒屬植物,該植物始載于《本草圖經(jīng)》,主要分布于我國(guó)西南各省。竹葉椒為湖北省特色植物之一,作為藥用植物和熏香材料由來(lái)已久,民間多用來(lái)行氣消腫、祛風(fēng)散瘀、活血止痛、祛蛔、治胃痛[8-10]?，F(xiàn)代研究表明，竹葉椒的根、莖、葉、果實(shí)均可入藥,主要含精油、香豆素、木脂素和微量元素等成分,具有抗菌、抗炎、增強(qiáng)免疫等作用[11-12]。因此,分析竹葉椒果實(shí)精油的化學(xué)成分并對(duì)其進(jìn)行功能性評(píng)價(jià)具有重要意義。

目前對(duì)竹葉椒果雖有研究,但是對(duì)其產(chǎn)生功能性的成分、特性等研究較少。本文通過(guò)提取竹葉椒果實(shí)精油,利用GC-MS分析其精油的成分,并采用熏蒸的方法進(jìn)行小鼠抗疲勞、抗氧化、安眠鎮(zhèn)靜的藥理實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步評(píng)價(jià)竹葉椒果實(shí)精油的藥理功能,為開(kāi)發(fā)竹葉椒果實(shí)精油保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種雄性小鼠(KM小鼠) 6周齡，健康,體重20～25 g,購(gòu)于三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,合格證號(hào):XSD2016110007;竹葉椒果實(shí) 產(chǎn)自湖北省恩施州宣恩縣珠山鎮(zhèn)解放街);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

FA-1004B型電子天平 上海精密儀器有限公司;DFY-500型搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、水蒸氣蒸餾裝置 天津泰斯特儀器有限公司;TDL-80-2B型低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Agilent6890GC-5973MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司;5V-1A型圣蘭德干熱揮發(fā)器 恩施州紅霞化工有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 竹葉椒果實(shí)精油的提取 參考[13-15]的方法,取鮮重10 kg的竹葉椒果實(shí),用自來(lái)水清洗3次后，用蒸餾水清洗一次,置于通風(fēng)的陰涼干燥處,自然風(fēng)干至恒重。采用水蒸氣蒸餾法，在料液比1∶30 g/mL，微波輔助2.0 min,蒸餾時(shí)間100 min的條件下，提取竹葉椒果實(shí)精油,將制得的竹葉椒果實(shí)精油經(jīng)無(wú)水硫酸鈉除去多余水分,備用。

1.2.2 精油成分分析 GC條件:HP-5MS氣相毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。樣品進(jìn)樣口:GC。進(jìn)樣方式:手動(dòng)。柱箱:平衡時(shí)間1 min,升溫條件:40 ℃保持5 min,然后3 ℃/min升高到90 ℃,保持5 min,然后8 ℃/min 升高230 ℃，保持5 min?？傔\(yùn)行時(shí)間:49.167 min[16]。

MS條件:EI離子源;溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;電子倍增器電壓1.6 kV;質(zhì)量掃描范圍45～400 m/z[17]。

主要成分選擇標(biāo)準(zhǔn):通過(guò)質(zhì)譜掃描后得出相應(yīng)的質(zhì)譜圖,質(zhì)譜譜庫(kù)檢索選擇匹配度大于90%的物質(zhì)。

1.2.3 動(dòng)物分組與處理 以竹葉椒果實(shí)精油為材料,采用干熏蒸法、加強(qiáng)熏蒸法兩種熏香方式處理小鼠；采用低、中、高三種處理濃度分別對(duì)應(yīng)處理時(shí)間為1、2、3 h(精油濃度分別為1.25、2.5、3.75 mL/m3)。

干熱熏蒸法:熏香處理中用體積0.8 m3的紙箱罩住鼠籠,采用圣蘭德干熱揮發(fā)器調(diào)整精油揮發(fā)速度,每天正常飲食,上午9點(diǎn)～12點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行熏香?？刂凭蛽]發(fā)劑量為1 mL/h,研究每天熏香處理1、2、3 h對(duì)小鼠的影響,每組小鼠20只。空白組20只小鼠,不進(jìn)行熏蒸處理。

加濕熏蒸法:熏香處理中用體積0.8 m3的紙箱罩住鼠籠,將3 mL精油加5 mL 80%乙醇混合,溶于1 L水中,調(diào)水至恒溫90 ℃,用霧化器調(diào)節(jié)霧化速度為0.33 L/h,研究每天熏香處理1、2、3 h對(duì)小鼠的影響,每組小鼠20只,空白組20只小鼠,不進(jìn)行熏蒸處理。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1.2.4.1 抗氧化測(cè)定 小鼠連續(xù)熏香處理30 d后,每組取8只,禁食1 d,斷頭取血。血樣于4 ℃的冰箱中靜置后,在離心機(jī)中以4000 r/min離心20 min,取上清液,分別按照SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒說(shuō)明書方法，測(cè)定血清中SOD活性、和GSH-Px活力與MDA含量[18]。

1.2.4.2 抗疲勞測(cè)定 游泳時(shí)間:小鼠連續(xù)熏香處理30 d后,取6只讓其在恒溫水槽中進(jìn)行負(fù)重游泳(游泳過(guò)程中小鼠尾部綁有體重10%的鉛絲),水槽深度50 cm,水溫(27±5) ℃。記錄從小鼠開(kāi)始沉入水面下10 s后不能浮出水面的時(shí)間,此時(shí)間即為游泳力竭時(shí)間[19]。

爬桿時(shí)間:小鼠連續(xù)熏香處理30 d后,取6只進(jìn)行爬桿試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)前訓(xùn)練30 min,將小鼠置于玻璃棒上,玻璃棒直徑1 cm,記錄小鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒上跌下的時(shí)間[20]。

1.2.4.3 凝神效果 熏香處理小鼠后每周測(cè)一次小鼠睡眠發(fā)生率,每天15點(diǎn)為飼料投放時(shí)間,在投放飼料2 h內(nèi)，觀察記錄各實(shí)驗(yàn)組入睡動(dòng)物數(shù),小鼠翻正反射消失達(dá)1 min以上的鼠數(shù)為入睡動(dòng)物數(shù),測(cè)小鼠睡眠發(fā)生率[21]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉椒果實(shí)精油中各化學(xué)成分GC-MS圖譜

采用GC-MS對(duì)竹葉椒果實(shí)精油進(jìn)行分析,所得總離子流圖見(jiàn)圖1,鑒定其成分,通過(guò)質(zhì)譜圖面積計(jì)算含量。

2.2 竹葉椒果實(shí)精油主要成分分析結(jié)果

竹葉椒果實(shí)精油中共檢測(cè)出59種化學(xué)成分,從中鑒定出25種物質(zhì),所檢測(cè)的成分占精油總量的82.61%。由表1所示,竹葉椒果實(shí)精油中主要為醇類物質(zhì)和烯類物質(zhì);醇類物質(zhì)9種,占精油總量的39.22%;烯類物質(zhì)12種,占精油總量的36.94%;酯類物質(zhì)1種,占精油總量的1.33%;酮類物質(zhì)1種,占精油總量的0.11%;苯類物質(zhì)1種,占精油總量的1.03%。在鑒定的25種成分中,桉葉油醇(36.19%)、萜品烯(21.31%)和3-蒈烯(8.45%)是構(gòu)成竹葉椒果實(shí)精油的主要成分。

表1 竹葉椒果實(shí)精油主要成分分析結(jié)果Table 1 Analysis results of main components in essential oil of Zanthoxylum armatum DC.

萜品烯對(duì)植物氧化性損傷具有顯著的修復(fù)作用,且單獨(dú)作用或和其他物質(zhì)協(xié)同作用均可[23]。甜橙精油中含有大量烯類物質(zhì),其中包含α蒎烯、萜品烯、3-蒈烯等,且3-蒈烯所占比例較高[24],甜橙精油具有增強(qiáng)小鼠運(yùn)動(dòng)能力、緩解小鼠抑郁癥狀的作用[25]。

陳玉等[16]研究了竹葉椒樹(shù)皮中的化學(xué)成分,主要有白屈菜紅堿、卡瑞花椒堿、4-甲氧基-1-甲基-2-喹諾酮等11種物質(zhì),其中主要以生物堿和同類物質(zhì)為主,和本文所測(cè)成分相比可得,同種植物不同部位的化學(xué)成分相差巨大。劉建華等[26]對(duì)貴州產(chǎn)竹葉椒果實(shí)的精油中進(jìn)行研究,從中分析出32個(gè)組分,烯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)為主要成分,和本文研究結(jié)果相似;但是其中β-石竹烯、α-葎草烯、L-芳樟醇、α-蒎烯含量較高,和本文存在差異,對(duì)比本文研究可知,同種植物同種部位竹葉椒，由于種植環(huán)境不同，其化學(xué)成分也不同。

2.3 竹葉椒果實(shí)精油熏香對(duì)小鼠抗氧化效果的影響

由表2～表3得出,通過(guò)30 d的處理后,兩種方法對(duì)小鼠血清中的SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量都有一定的影響,隨著劑量的加大,SOD活力和GSH-Px活力呈逐漸升高趨勢(shì),MDA含量呈逐漸降低趨勢(shì)。

表2 干熱熏蒸法處理小鼠血清中抗氧化指標(biāo)Table 2 Antioxidant indexes in serum of mice of dry heat fumigation treatment

表3 加濕熏蒸法處理小鼠血清中抗氧化指標(biāo)Table 3 Antioxidant indexes in serum of mice of humidification fumigation treatment

由表2可得,干熱熏蒸法處理小鼠過(guò)程中,和對(duì)照相比，低劑量的SOD活力稍有增加,但差異不顯著(p>0.05),中劑量和高劑量組和對(duì)照相比達(dá)到顯著性差異(p<0.05);三個(gè)劑量組和對(duì)照組相比,GSH-Px活力均達(dá)到顯著性差異(p<0.05);對(duì)于小鼠血清中MDA含量，中、高劑量組和對(duì)照相比，均達(dá)到顯著性差異(p<0.05)。

由表3可得,加濕熏蒸法處理小鼠過(guò)程中,處理組和對(duì)照組相比,三個(gè)劑量組的SOD活力均達(dá)到顯著性差異(p<0.05);處理組和對(duì)照組相比,中、高劑量組的GSH-Px活力達(dá)到顯著性差異(p<0.05);處理組和對(duì)照相比,三個(gè)劑量組的MDA含量均達(dá)到顯著性差異(p<0.05)。綜上所述,兩種處理方式過(guò)程中,當(dāng)0.8 m3的體積中竹葉椒果實(shí)精油劑量達(dá)到2 h時(shí),對(duì)小鼠血清中的SOD和GSH-Px活力有顯著增加作用(p<0.05),對(duì)MDA含量有顯著降低作用(p<0.05),說(shuō)明對(duì)小鼠有較強(qiáng)的抗氧化功效。

干熱熏蒸法和加濕熏蒸法兩種處理方式之間對(duì)比,從整體上看加濕熏蒸法的SOD、GSH-Px活力較強(qiáng),MDA含量較低,且兩種處理方式最高劑量組的三個(gè)檢測(cè)指標(biāo)均與對(duì)照組達(dá)到顯著性差異(p<0.05)。對(duì)比兩種處理方式,對(duì)小鼠抗氧化性效果來(lái)看,加濕熏蒸法要強(qiáng)于干熱熏蒸法。

2.4 竹葉椒果實(shí)精油熏香對(duì)小鼠抗疲勞效果的影響

由表4～表5得出,在處理30 d后,兩種熏香方式三種劑量均能增加小鼠負(fù)重游泳和爬桿時(shí)間,且中、高劑量組達(dá)到顯著水平(p<0.05);對(duì)于小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的提升大于小鼠爬桿時(shí)間,在高劑量組的兩種處理方式下,小鼠負(fù)重游泳時(shí)間延長(zhǎng)率分別達(dá)到74%、99%;兩種處理方式對(duì)比,加濕熏蒸法對(duì)抗疲勞的效果更明顯。

表4 竹葉椒果實(shí)精油熏香對(duì)小鼠游泳時(shí)間的影響Table 4 Effect of incense on swimming time of mice

表5 竹葉椒果實(shí)精油熏香對(duì)小鼠爬桿時(shí)間的影響Table 5 Effect of incense on pole climbing time of mice

2.5 竹葉椒果實(shí)精油熏香對(duì)小鼠凝神效果的影響

由表6得出,在處理1周后,干熱熏蒸法處理對(duì)小鼠睡眠發(fā)生率效果不顯著(p>0.05),加濕熏蒸法處理對(duì)睡眠發(fā)生率有一定的增效作用;在處理2周及2周以后,兩種處理方式各劑量均能提高睡眠發(fā)生率,除干熱熏蒸法低劑量處理組外，均達(dá)到顯著性差異(p<0.05);處理4周后,加濕熏蒸法高劑量處理組對(duì)小鼠睡眠發(fā)生率影響最大,睡眠發(fā)生增加率為27.5%。

表6 竹葉椒果實(shí)精油熏香處理小鼠后睡眠發(fā)生率(%)Table 6 The incidence rate of sleeping of mice after treatment of incense(%)

3 結(jié)論與討論

竹葉椒果實(shí)精油經(jīng)GC-MS鑒定出25種成分,其中主要成分有三種,分別為桉葉油醇(36.19%)、和萜品烯(21.31%)和3-蒈烯(8.45%)?？寡趸囼?yàn)中,竹葉椒果實(shí)精油對(duì)小鼠血清中SOD、GSH-Px均有提升作用,對(duì)MDA含量有降低作用,說(shuō)明在研究的劑量范圍內(nèi),竹葉椒果實(shí)精油對(duì)小鼠有很好的抗氧化效果?？蛊谠囼?yàn)中,對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和爬桿時(shí)間均有增加作用,說(shuō)明對(duì)小鼠抗疲勞有很好的效果。通過(guò)觀測(cè)小鼠進(jìn)食后2 h內(nèi)的睡眠率可以發(fā)現(xiàn),精油熏香處理可以增加小鼠睡眠率,且隨著時(shí)間和劑量的增加效果更明顯。從處理方式來(lái)看,在試驗(yàn)劑量相同的情況下，在抗氧化效果、抗疲勞程度、增進(jìn)睡眠方面，加濕熏蒸法都比干熱熏蒸法效果好。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，各方面指標(biāo)顯示劑量越高，效果越好，且未發(fā)現(xiàn)任何不適現(xiàn)象,竹葉椒作為一種熏香材料具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>