胡守珍，畢生雷，黃麗麗，鄒婷婷，郭樂樂，楊迪，張乃群*

1 (南陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河南 南陽,473061) 2 (河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車用生物燃料技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽,473000)

小球藻(Chlorella)屬綠藻門,綠藻綱,綠藻目,卵胞藻科,小球藻屬[1]，有自養(yǎng)、異養(yǎng)、兼養(yǎng)3種培養(yǎng)方式[2-3]。小球藻在生產(chǎn)油脂的同時(shí)還能產(chǎn)生如蛋白質(zhì)、小球藻生長因子、色素、多不飽和脂肪酸等高附加值產(chǎn)物[4-5]。小球藻中的蛋白質(zhì)種類非常豐富，其氨基酸組成超過FDA頒布的用于人類食品的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)[6]。小球藻生長因子不僅可以改善機(jī)體酸性環(huán)境，還能夠增強(qiáng)免疫力[7]、延緩衰老、更好更快修復(fù)受傷組織[8-10]。以藻蛋白為主的小球藻保健產(chǎn)品在日本、東南亞、我國臺灣地區(qū)每年銷售量都位居前列，具有很好的經(jīng)濟(jì)前景[11]，而產(chǎn)油效率遠(yuǎn)高于油料作物的小球藻也屢屢成為國家級科研資金資助的研究目標(biāo)[12]。因此，隨著能源危機(jī)和糧食安全加劇，基于小球藻生產(chǎn)油脂、蛋白質(zhì)等高附加值產(chǎn)品的技術(shù)受到人們的廣泛關(guān)注[13]，其中異養(yǎng)小球藻具有生長速度快、生物量高、含油量高、占用土地面積小[14]、能夠利用工業(yè)化設(shè)備實(shí)現(xiàn)藻體高密度規(guī)模化培養(yǎng)等特點(diǎn)受到研究人員重點(diǎn)關(guān)注[15-17]。但是由于異養(yǎng)小球藻產(chǎn)油技術(shù)的高成本導(dǎo)致該產(chǎn)業(yè)規(guī)模仍然較小[18-20]，如果能夠在提油之前將小球藻產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提取出來，不僅使小球藻物盡其用，還可以降低異養(yǎng)小球藻產(chǎn)油的生產(chǎn)成本[21-25]。

由于自養(yǎng)小球藻生產(chǎn)成本低、蛋白質(zhì)含量和品質(zhì)相對較高[26-27]，現(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于小球藻蛋白質(zhì)的提取聚焦于自養(yǎng)小球藻[28-30]，但是高產(chǎn)蛋白的自養(yǎng)小球藻含油量極少、規(guī)?；囵B(yǎng)受到自然條件和場地限制較大，生產(chǎn)過程難以控制，會造成不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量差異較大[31-33]。相對于藻蛋白市場，藻油可用于制成食用油、生物柴油[34-36]、是用途廣泛、市場容量巨大的產(chǎn)品[37]，提取異養(yǎng)小球藻的蛋白質(zhì)，有助于降低藻油的生產(chǎn)成本，從而為提高人類生活品質(zhì)、解決人類生存問題作出貢獻(xiàn)[38]。本研究使用的異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻，原材料充足、藻體密度大、質(zhì)量穩(wěn)定，具有很好的研究價(jià)值和經(jīng)濟(jì)意義[39]。

小球藻細(xì)胞壁堅(jiān)韌，如果不能將其有效破碎，其中的營養(yǎng)成分難以被充分提取，因此小球藻細(xì)胞破碎技術(shù)至關(guān)重要[40]。目前國內(nèi)外對于藻類細(xì)胞常用的破壁技術(shù)有超聲波法、高壓均質(zhì)法、纖維素酶解等。曲文娟等[41]使用脈沖超聲技術(shù)提取鈍頂螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白，蛋白得率為13.45%，比凍融法高10.26%。王曉琴等[42]利用高壓均質(zhì)機(jī)對小球藻進(jìn)行破壁，蛋白提取率為45.78%。陳藝煊等[43]使用纖維素酶對蛋白核小球藻進(jìn)行破壁，破壁率為82.25%。但這些技術(shù)存在著處理量小、破壁效果差，且設(shè)備及材料成本較高、不適合規(guī)?；a(chǎn)等缺點(diǎn)，因此尋找更為經(jīng)濟(jì)有效的破壁方法勢在必行，本研究借鑒植物蛋白提取的常用的“堿提酸沉”法來提取異養(yǎng)小球藻中的蛋白質(zhì)[44-45]，并進(jìn)行工藝優(yōu)化，旨在為異養(yǎng)小球藻高附加值利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異養(yǎng)小球藻藻粉(蛋白含量：12.163%，水分含量：1%)；

考馬斯亮藍(lán)、牛血清蛋白，北京索萊寶科技有限公司；NaOH、乙醇、H3PO4均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DGG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海有限公司)；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SKD-100型凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；WFJ2100型分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；高速粉碎機(jī)，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小球藻粉中水分含量的測定

按GB/T5009.3—2003.105 ℃恒重法(恒質(zhì)量法)測得小球藻粉中水分含量為1%。

1.3.2 小球藻粉中蛋白質(zhì)含量的測定

利用凱氏定氮法檢測。

1.3.3 提取液蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定，以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推測提取液樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 小球藻蛋白質(zhì)提取率

小球藻蛋白質(zhì)提取率按式(1)計(jì)算。

蛋白質(zhì)提取率/%=

(1)

1.3.5 小球藻粉中蛋白質(zhì)的提取流程

異養(yǎng)小球藻粉在電熱恒溫干燥箱中105 ℃烘干至衡重，取適量處理過的小球藻粉于錐形瓶中，按照設(shè)定的試驗(yàn)條件來提取其中的蛋白質(zhì)。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 NaOH的添加量對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響

固定液料比為50∶1，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間為1 h，分別在5%、10%、15%、20%、25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaOH添加量下進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.2 液料比對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響

固定NaOH添加量為20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間為1 h，分別在20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1的液料比下進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.3 提取時(shí)間對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響

固定NaOH添加量為20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，液料比為50∶1，提取溫度60 ℃，分別在20、40、60、80、100、120 min的提取時(shí)間下進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.4 提取溫度對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響

固定NaOH添加量為20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，液料比為50∶1，提取時(shí)間為40 min，分別在40、45、50、55、60、65、70 ℃的提取溫度下進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取NaOH的添加量、液料比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素作為試驗(yàn)因素，以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用L9(34)正交表，試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)測得蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6.446 6x+0.023 9，R2=0.995 9。其中y為A595nm的數(shù)值，x為溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。

圖1 牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of the bovine serum albumin

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 NaOH的添加量對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響

堿溶液提取蛋白質(zhì)過程中，pH值是影響蛋白質(zhì)提取效果的重要因素，但是在提取過程中pH值會發(fā)生變化，且不易控制，因此選擇NaOH的添加量進(jìn)行研究更為方便可行[46]。由圖2可以看出，NaOH的添加量對小球藻蛋白質(zhì)的提取率有較大的影響，在NaOH的添加量比較小的時(shí)候，蛋白質(zhì)的提取率比較低，并且蛋白質(zhì)的提取率隨著NaOH的添加量的增加而提高，因?yàn)樵趬A性環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)由緊密變?yōu)槭杷?，蛋白質(zhì)分子之間相互排斥，同時(shí)堿性溶液會破壞蛋白質(zhì)分子的次級鍵尤其是氫鍵，這些作用會使蛋白質(zhì)溶解性增加，并且這種增溶作用會隨著NaOH添加量的增加而增強(qiáng)[47]，所以蛋白質(zhì)提取率隨著NaOH添加量的增加而上升。但是當(dāng)NaOH的添加量超過20%并且繼續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率不升反降，并有異味產(chǎn)生，可能是因?yàn)镹aOH添加量過高造成了蛋白質(zhì)過度水解，部分氨基酸發(fā)生縮合反應(yīng)產(chǎn)生異味物質(zhì)[48]。江懷真等[49]利用熱堿法提取小球藻蛋白質(zhì)，在NaOH的添加量為15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))時(shí)，蛋白質(zhì)提取率約為43%，本實(shí)驗(yàn)為39.19%，可能是因?yàn)榻瓚颜娴热嗽囼?yàn)所用小球藻粉蛋白含量(55.8%)高于本實(shí)驗(yàn)(12.163%)，提取液蛋白質(zhì)含量測定使用的是凱氏定氮法，而本實(shí)驗(yàn)使用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定，因此本實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)提取率與之對比相對較低。NaOH添加量的單因素試驗(yàn)結(jié)果與江的相當(dāng)，因此，NaOH的最佳添加量定為20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

圖2 NaOH的添加量對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of the adding ratio of NaOH on the extractionof the chlorella protien

2.2.2 液料比對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖3可以看出，液料比對小球藻蛋白質(zhì)提取率也有較大的影響，液料比較小時(shí)蛋白質(zhì)提取率較低，可能是因?yàn)榧铀刻偃芤吼こ?，分子擴(kuò)散速度慢，影響蛋白質(zhì)分子的溶解。當(dāng)液料比從20∶1增大到50∶1時(shí)，蛋白質(zhì)提取率提高比較明顯，由32.26%提高至43.96%，等量蛋白質(zhì)由過飽和狀態(tài)變?yōu)椴伙柡蜖顟B(tài)，所以蛋白質(zhì)溶解性增加[50]。而當(dāng)液料比從50∶1增大到80∶1，料液比幾乎增大了1倍，但是蛋白質(zhì)提取率卻只提高了3.38%，盡管提取率仍然有所提高，但是結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，較高的液料比會導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度過低，提取過程中的損耗會增大，而且會造成后期蛋白質(zhì)的純化難度大大增加[51]，因此選擇液料比為50∶1。

圖3 液料比對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of the liquid-solid ratio on the extraction ofthe chlorella protien

2.2.3 提取時(shí)間對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖4可知，熱堿法對小球藻細(xì)胞壁的破壞作用較強(qiáng)，提取20 min時(shí)，蛋白質(zhì)提取率已經(jīng)達(dá)到45.74%，隨著提取時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)提取率繼續(xù)增加，在40 min時(shí)提取率達(dá)到最高，為50.42%，此時(shí)小球藻中的大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)溶出，因?yàn)槌^40 min后，蛋白質(zhì)的提取率開始緩慢下降，這表明蛋白質(zhì)的溶出過程與時(shí)間密切相關(guān)，提取時(shí)間太短，蛋白質(zhì)溶解不充分，提取時(shí)間過長，又會造成蛋白質(zhì)的變性或者其他組分溶出量增大，使得蛋白質(zhì)提取率降低[52]。所以選擇提取時(shí)間為40 min。

圖4 提取時(shí)間對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of the time on the extraction of the chlorellaprotien

2.2.4 提取溫度對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響

溫度直接影響物質(zhì)在溶液中的溶解性，因此溫度對蛋白質(zhì)提取率有顯著的影響。由圖5可知，在溫度為40～50 ℃，蛋白質(zhì)提取率基本沒有變化，可能是溫度較低，小球藻的細(xì)胞壁未能有效破碎，但是在溫度為50～60 ℃，蛋白質(zhì)提取率隨著溫度的升高迅速提高，在溫度為60 ℃時(shí)提取率達(dá)到最高，為53.16%，可能是由于在該溫度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，立體結(jié)構(gòu)舒展，與水的相互作用增強(qiáng)[47]，蛋白質(zhì)溶出量增大。溫度超過60 ℃以后，蛋白質(zhì)提取率不升反降，可能是由于溫度過高造成蛋白質(zhì)變性，這與前人的研究結(jié)果一致[53]。所以提取溫度取60 ℃。

圖5 提取時(shí)間對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of the temperature on the extraction of thechlorella protien

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

為了比較NaOH的添加量、液料比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響，使用正交試驗(yàn)法來確定小球藻蛋白質(zhì)的最佳提取條件，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test

由正交試驗(yàn)R值分析可知，4個(gè)因素對小球藻蛋白質(zhì)提取率的影響次序?yàn)锳>B>D>C,即NaOH添加量>液料比>提取溫度>提取時(shí)間，進(jìn)一步的方差分析表明(表3)，4個(gè)因素中，提取時(shí)間對小球藻蛋白質(zhì)的提取有顯著影響，最優(yōu)組合為A2B2C1D2，即NaOH添加量20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，液料比50∶1，提取時(shí)間20 min，提取溫度60 ℃。以該自由組合條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出在該條件下小球藻蛋白質(zhì)提取率為54.98%，與正交試驗(yàn)中提取率最高的一組A2B2C3D1進(jìn)行比較，可知小球藻最佳提取條件為A2B2C3D1，即NaOH添加量20%，液料比50∶1，提取時(shí)間60 min，提取溫度55 ℃，此條件下小球藻蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)55.24%。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

3 結(jié)論

藻類細(xì)胞破碎方法有很多，但常用的藻類細(xì)胞破碎方法多不適合工業(yè)化應(yīng)用，本文參考植物蛋白提取常用的“堿提酸沉法”來提取異養(yǎng)小球藻粉中的蛋白質(zhì)，研究了熱堿法提取小球藻蛋白質(zhì)的條件，經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對熱堿法提取小球藻蛋白質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到熱堿法提取小球藻蛋白質(zhì)的最佳條件為：NaOH添加量20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，液料比50∶1，提取時(shí)間60 min，提取溫度55 ℃，此條件下小球藻蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)55.24%。此法所用儀器簡單、操作簡便易行、處理量大、提取效果明顯、成本低，且在后續(xù)蛋白質(zhì)的提純過程中可加入HCl來調(diào)節(jié)等電點(diǎn)使蛋白質(zhì)沉淀，并且中和了提取過程中添加的堿，不會對環(huán)境造成污染，也不影響提取出來的蛋白質(zhì)作為保健品來食用，因此該法非常適合工業(yè)化應(yīng)用，具有很好的應(yīng)用前景，本研究為異養(yǎng)小球藻產(chǎn)油技術(shù)經(jīng)濟(jì)最大化提供了參考。