HPLC法測定梵凈山野生八角蓮中黃酮類化合物的含量

陳仕學(xué)，魯?shù)劳υ?，陳美航，程小濤，萬 鵬

(銅仁學(xué)院，材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

八角蓮(Dysosma versipellis (Hance) M. Cheng ex Ying 是小檗科八角蓮屬植物，又稱為鬼臼屬植物，是我國獨(dú)特的植物物種[1]。八角蓮是用根莖來作為藥材，主要是有散熱解毒、活血散瘀的功效，還用于乳腺癌腫，發(fā)炎癥，腮炎腫痛等疾病的治療[2]。在2011年已經(jīng)有人從八角蓮植物中鑒別了約14個化合物，其中就分離出木質(zhì)素和黃酮類成分，其中的黃酮類化合物包括槲皮素和山奈酚[3]。槲皮素主要具有抗氧化和消除氧自由基的功效, 能降低血壓, 增強(qiáng)免疫功能[4]；山萘酚主要具有預(yù)防癌變、癲癇，抗氧化、消炎止咳等作用[5]。

目前，對八角蓮的研究主要對鬼鬼臼毒素的研究較多，但關(guān)于梵凈山野生八角蓮黃酮類化合物中槲皮素和山奈酚這兩種物質(zhì)的含量測定還未見報道，本實(shí)驗(yàn)主要采用高效液相色譜法測定其槲皮素、山奈酚這兩種物質(zhì)的含量，為本地八角蓮藥材的開發(fā)、利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

八角蓮藥材采購于貴州梵凈山，洗干凈，用干燥箱烘干，粉碎密封，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

乙醇、分析純，甲醇、乙腈、磷酸、槲皮素(>98.5%)、山奈酚色譜純(>98%)均為色譜純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，電熱鼓風(fēng)干燥箱、移液槍、高效液相色譜、色譜柱、柱溫箱、超聲波、自動進(jìn)樣器、泵、檢測器，日本島津有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原材料的預(yù)處理

先將八角蓮洗凈，烘干，打成粉末。稱取八角蓮樣品粉末放入燒杯中，同時加入石油醚，樣品粉末與石油醚按照1∶5(g/mL)的比例，放置，浸泡3 h后，抽濾后烘干，備用。

2.2 黃酮類化合物的提取以及樣品液的制備

2.2.1 提取

稱取上述的粉末(由2.1制備)與95%乙醇按照1∶10 (g/mL)的比例放入錐形瓶中，放入60℃電熱恒溫水浴鍋中，加熱1 h后進(jìn)行冷卻，并進(jìn)行抽濾，將所得濾液在40～60℃下進(jìn)行旋蒸，濃縮至干。此時加入60～70℃的蒸餾水溶解，同時加入幾滴無水乙醇進(jìn)行較好溶解(這個過程需在60℃的熱水中進(jìn)行)，抽濾之后得到濾液，將濾液放置冰箱冷藏24 h，進(jìn)行重結(jié)晶，靜置到次日再進(jìn)行抽濾，放入烘箱烘干(45℃，5～10 min)，得粉末狀八角蓮總黃酮類物質(zhì)。

2.2.2 樣品液的制備

稱取上述物質(zhì)5 mg于25 mL容量瓶中，滴加甲醇溶解后，用超聲處理10 min，之后用甲醇定容搖勻，即得樣品液。

2.3 混標(biāo)貯備液的配制

精密稱取兩種標(biāo)準(zhǔn)品，其中槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品1.5 mg，山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品1.4 mg，置4mL 樣品瓶中，甲醇溶解，超聲處理10 min，稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，作為混標(biāo)貯備液[6]。

2.4 色譜條件中流動相的選擇

本次實(shí)驗(yàn)流動相采取甲醇-0.4%磷酸水溶液與乙腈-0.4%磷酸水溶液進(jìn)行選擇，通過它們的不同比例和流速對槲皮素和山奈酚混標(biāo)貯備液以及樣品進(jìn)行分離，每次都在同一色譜條件下(色譜柱：4.6×250mm，5μm；進(jìn)樣20μL；分析波長362nm；柱溫25℃)觀察分離度和峰形，選擇最佳比例與流速。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取由上述2.3中的混標(biāo)貯備液20、40、60、80、100μL，甲醇定容為1mL溶液，配成濃度梯度液。按照最佳色譜條件進(jìn)樣，以槲皮素、山奈酚這兩種物質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一份由上述2.3中的混標(biāo)貯備液20μL注入高效液相色譜儀，按照最佳色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到色譜圖，根據(jù)峰面積，計(jì)算得到槲皮素和山奈酚分別對應(yīng)的RSD。

2.7 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精密吸取上述2.2中的樣品液，平行進(jìn)樣2次，按照最佳色譜條件進(jìn)行測定，得到色譜圖，根據(jù)峰面積，計(jì)算槲皮素和山奈酚分別對應(yīng)的RSD。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一樣品溶液(由2.2制備)，按照最佳色譜條件，分別在4、8、12、16、20、24h進(jìn)樣20μL，測定槲皮素和山奈酚的含量，計(jì)算其對應(yīng)的RSD。

2.9 樣品含量測定實(shí)驗(yàn)

精密吸取樣品溶液(由2.2制備)，按照最佳色譜條件測定槲皮素和山奈酚的平均含量(n=5)。

2.10 回收率實(shí)驗(yàn)

取6份已知含量的樣品，每份約0.0437mg，按照上述2.2的方法制備成樣品液；精密吸取此樣品液500μL，加入混標(biāo)貯備液(按照2.3制備而成)500μL，按照最佳色譜條件，測定其回收率。并用同樣的方法測山奈酚。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件中流動相的選擇

實(shí)驗(yàn)的流動相采取甲醇-0.4%磷酸水溶液與乙腈-0.4%磷酸水溶液兩種進(jìn)行選擇，通過它們的不同比例和流速對槲皮素和山奈酚混標(biāo)貯備液以及樣品進(jìn)行分離，觀察分離度和峰形，選擇最佳比例與流速。

3.1.1 流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液

實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象見表1。

表1 甲醇-0.4%磷酸水溶液為流動相

3.1.2 流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液

實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象見表2。

表2 乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動相

由表1、表2，可確定最佳色譜條件：流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液(35%：65%)，流速為0.7000mL/min，色譜柱為C18 柱(4.6×250mm，5μm)，進(jìn)樣20μL；分析波長362nm；柱溫25℃。在此最佳條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

混標(biāo)貯備液按照2.5中的方法精密吸取，配制成濃度梯度混標(biāo)溶液。在3.1中的色譜條件下進(jìn)樣(n=5)，以槲皮素、山奈酚兩種物質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可得：槲皮素回歸方程為：Y =7X+5.81311e；槲皮素在0.0075～0.0375 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(R2=0.9999，n=5)。

圖2 山奈酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可得：山奈酚回歸方程為：Y=7X+9.23054e；山奈酚在0.007～0.035 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(R2=0.9998，n=5)。

3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

在2.6的條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算得到槲皮素和山奈酚分別對應(yīng)的RSD。

槲皮素：計(jì)算所得n=6，RSD(槲皮素)=0.56%；山奈酚：計(jì)算所得n=6，RSD(山奈酚)=0.58%，結(jié)果說明儀器精密度良好。

3.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

由2.7中的條件平行進(jìn)樣2次，計(jì)算得到槲皮素和山奈酚分別對應(yīng)的RSD。

槲皮素：計(jì)算所得，RSD(槲皮素)= 0.27%；

山奈酚：計(jì)算所得，RSD(山奈酚)= 0.22%，表明此方法重現(xiàn)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由2.8中的條件24h內(nèi)，每4h進(jìn)樣一次(n=6),測定槲皮素和山奈酚的含量，計(jì)算其對應(yīng)的RSD。

槲皮素：計(jì)算所得，RSD(槲皮素)= 0.21%；

山奈酚：計(jì)算所得RSD(山奈酚)= 0.18%，結(jié)果表明在24h內(nèi)對樣品溶液進(jìn)行檢驗(yàn)，對結(jié)果無影響，穩(wěn)定性良好。

3.6 樣品含量測定實(shí)驗(yàn)

在2.9的條件下，測定槲皮素和山奈酚這兩種物質(zhì)的平均含量。

表3 樣品平均含量

由表3可得：在八角蓮黃酮類化合物中槲皮素平均含量為5.92%，山奈酚平均含量為1.95%。

3.7 回收率實(shí)驗(yàn)

由2.10中的條件，測定的回收率。

表4 槲皮素的回收率

表5 山奈酚的回收率

由表4、表5可知：槲皮素的回收率為100.90%，RSD為2.49%；山奈酚的回收率為101.07%，RSD為3.81%。

3.8 不同產(chǎn)地八角蓮黃酮類化合物中槲皮素和山奈酚含量比較

表6 不同產(chǎn)地八角蓮黃酮類

由表6可知，不同產(chǎn)地八角蓮黃酮類化合物的槲皮素和山奈酚的含量有所不同，其中梵凈山的比其他地方的含量高，但貴州黔南的與梵凈山十分接近。

4 結(jié)論

本文用高效液相色譜法對八角蓮中槲皮素和山奈酚這兩種物質(zhì)的含量進(jìn)行測定，根據(jù)兩種化合物的分離度、出峰時間以及峰形不同，確定了這次實(shí)驗(yàn)的最佳色譜條件：流動相為乙腈-0.4%磷酸水溶液(35%:65%)，流速為0.7000mL/min，色譜柱為C18 柱(4.6×250mm，5μm)，進(jìn)樣量20μL；分析波長362nm；柱溫25℃。由此可知：八角蓮黃酮類化合物中槲皮素的含量為5.92%，山奈酚的含量為1.95%，這說明了再八角蓮中槲皮素和山奈酚的含量偏少。通過精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率等實(shí)驗(yàn)，證明用高效液相色譜法測定八角蓮中槲皮素和山奈酚的含量時，其優(yōu)點(diǎn)在于：精密度好，穩(wěn)定性高，八角蓮原材料預(yù)處理方法簡單，二者的分離度好，最佳條件下，沒有其他成分干擾，這為貴州本地的八角蓮藥材的質(zhì)量控制、開發(fā)等提供了有用的參考價值。