王瀟 陳健* 張?chǎng)?何劍全 黃慧

1. 廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361000 2. 廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院康復(fù)科，福建 廈門(mén) 361000

破骨細(xì)胞作為體內(nèi)唯一的骨再吸收細(xì)胞，它通過(guò)與骨表面之間形成微環(huán)境來(lái)降低骨基質(zhì)的成分[1]，所以破骨細(xì)胞是骨質(zhì)疏松和骨折預(yù)防和治療方面的重要靶點(diǎn)。研究表明，在骨吸收的過(guò)程中，附著于骨骼表面的破骨細(xì)胞在酸性的條件下先溶解骨礦物質(zhì)，繼而降解骨基質(zhì)成分。在此過(guò)程中，V-ATP酶的表達(dá)對(duì)骨吸收所必需的酸性微環(huán)境起到了至關(guān)重要的作用[2,3]。腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)對(duì)破骨細(xì)胞V-ATP酶表達(dá)的影響尚不十分明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察TNF-α及TNF-α抗體對(duì)破骨細(xì)胞V-ATP酶的影響，來(lái)探討TNF-α提高破骨細(xì)胞的骨吸收活性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠單核巨噬細(xì)胞株RAW264.7購(gòu)于上海傅衡生物科技有限公司，核因子κB受體活化因子配體(RANKL)(PeropTech,USA)，TNF-α(PeropTech,USA)，TNF-α抗體(abcam)，胰蛋白酶(GIBCO)，雙抗(HyClone)，胎牛血清(Biological Industries)，DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP) 染色試劑盒(Sigma)，TRIZOL(ambion)，RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)(TaKaRa)，熒光定量PCR 試劑(TaKaRa)，V-ATP酶抗體(GenScript)，引物(上海生工)，PCR擴(kuò)增儀(普通mycycler) (BIO-RAD，美國(guó))，ABI 7500 型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI)，F(xiàn)luorChem HD2成像系統(tǒng)(美國(guó)Protein slmple)。

1.2 破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)及鑒定

將RAW264.7細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)液(含10%的胎牛血清及1%的雙抗)，置入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(溫度為37 ℃，CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%)。24小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，加入50ng/mL的RANKL誘導(dǎo)因子。隔日換液1次，并保持RANKL的終濃度為50 ng/mL。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化情況。培養(yǎng)6天后做TRAP染色鑒定。按照TRAP染色試劑盒配置固定液和染色液。PBS洗1次，加固定液固定30 s，用去離子水徹底沖洗，再加TRAP染色液，置入37 ℃恒溫箱避光孵育1 h，在倒置顯微鏡下觀察并拍片。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞分為對(duì)照組，TNF-α干預(yù)組和TNF-α抗體干預(yù)組。均用50ng/mL的RANKL誘導(dǎo)8天，其中TNF-α干預(yù)組在RANKL誘導(dǎo)6天后分別用低濃度(20ng/mL)、中濃度(50ng/mL)、高濃度(80ng/mL)的TNF-α干預(yù)48 h；TNF-α抗體干預(yù)組在RANKL誘導(dǎo)6天后分別用低濃度(20ng/mL)、中濃度(50ng/mL)、高濃度(80ng/mL)的TNF-α抗體干預(yù)48 h。

1.4 V-ATP酶基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)：Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄設(shè)定的反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5s，4 ℃結(jié)束。在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，所用引物見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用20 μL反應(yīng)體系，包含前后引物各0.8 μL，10 μL SYBR?Premix Ex Taq II，0.4 μL ROX Reference Dye II，6 μL 無(wú)酶水與2 μL的cDNA。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 5s，60 ℃ 34 s 四十個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

表 1 real-time PCR所用目的基因及引物Table 1 Primers of genes used in real-time PCR

Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)：用RIPA緩沖液提取破骨細(xì)胞的總蛋白，煮沸變性10分鐘，進(jìn)行凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜。然后與V-ATP酶兔抗鼠單克隆一抗4 ℃孵育過(guò)夜，GAPDH作為內(nèi)參。羊抗兔IgG二抗孵育1 h。用Image J分析軟件檢測(cè)膜上每個(gè)條帶的相對(duì)灰度值，測(cè)出各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞檢測(cè)

接種24 h后，細(xì)胞開(kāi)始逐漸貼壁，體積較小，均勻一致。在50ng/mL的RANKL的誘導(dǎo)下，6天后可見(jiàn)很多體積較大的多核細(xì)胞，呈圓形、梭形或不規(guī)則形狀。TRAP染色呈陽(yáng)性(圖1)，細(xì)胞內(nèi)含有多個(gè)細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大小不等的空泡。

圖1 倒置相差顯微鏡下破骨細(xì)胞TRAP染色× 40Fig.1 Inverted phase contrast microscopic appearance of some typical rat osteoclast cells stained with TRAP (×40)

2.2 real-time PCR檢測(cè)V-ATP酶mRNA的表達(dá)

破骨細(xì)胞分別與TNF-α及TNF-α抗體經(jīng)過(guò)48 h共培養(yǎng)后，對(duì)照組、不同濃度TNF-α干預(yù)組及不同濃度TNF-α抗體干預(yù)組V-ATP酶的mRNA相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖2、圖3。低、中、高濃度TNF-α干預(yù)組V-ATP酶的mRNA 表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.000 1)；低、中、高濃度TNF-α抗體干預(yù)組V-ATP酶的mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.000 1)。該結(jié)果提示TNF-α能夠顯著提高V-ATP酶的mRNA表達(dá)；TNF-α抗體能夠顯著降低V-ATP酶的mRNA表達(dá)。

圖2 不同濃度TNF-α對(duì)V-ATP酶mRNA表達(dá)量的影響 (***P<0.000 1)Fig.2 Effect of different concentrations of TNF-alpha on the mRNA expression of V-ATPase

圖3 不同濃度TNF-α抗體對(duì)V-ATP酶mRNA表達(dá)量的影響 (***P<0.000 1)Fig.3 Effect of different concentrations of TNF-alpha antibody on the mRNA expression of V-ATPase

2.3 Western-blot檢測(cè)V-ATP酶蛋白的表達(dá)

破骨細(xì)胞分別與TNF-α及TNF-α抗體經(jīng)過(guò)48 h共培養(yǎng)后，對(duì)照組、不同濃度TNF-α干預(yù)組及不同濃度TNF-α抗體干預(yù)組V-ATP酶的蛋白表達(dá)見(jiàn)圖4、圖5。TNF-α干預(yù)組V-ATP酶蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；TNF-α抗體干預(yù)組V-ATP酶的蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。該結(jié)果提示TNF-α能夠顯著提高V-ATP酶的蛋白表達(dá)；TNF-α抗體能夠顯著抑制V-ATP酶的蛋白表達(dá)。

圖4 不同濃度TNF-α對(duì)破骨細(xì)胞V-ATP酶蛋白表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of different concentrations of TNF-alpha on the protein expression of V-ATPase

圖5 不同濃度TNF-α抗體對(duì)破骨細(xì)胞V-ATP酶蛋白表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of TNF-alpha antibody on the protein expression of V-ATPase

3 討論

TNF-α是參與骨骼重塑的幾種炎性細(xì)胞因子之一，它可以由正常的破骨細(xì)胞合成，主要作用是通過(guò)促進(jìn)破骨細(xì)胞形成和抑制成骨細(xì)胞的功能而維持骨代謝的穩(wěn)態(tài)[5]。TNF-α作為T(mén)NF 家族重要成員之一，可以刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL6 等因子，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞。也可以影響成骨細(xì)胞骨保護(hù)素(OPG)和RANKL的基因表達(dá)，從而調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和活化[6]。研究表明，TNF-α不僅可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，而且也可以提高破骨細(xì)胞的骨吸收活性[4]。

V-ATP酶是一種高度表達(dá)于破骨細(xì)胞膜上的特殊蛋白質(zhì)，對(duì)控制細(xì)胞內(nèi)的pH值的生理過(guò)程起著重要的作用，所以，其表達(dá)量對(duì)破骨細(xì)胞性骨吸收起著至關(guān)重要的作用[2,3]。V-ATP酶的核心結(jié)構(gòu)由V1和V0兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域及輔助亞基AC45和M8-9組成[7]。V1部分位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，是一個(gè)570 ku的復(fù)雜結(jié)構(gòu)域，由(A，B， C，D，E，F(xiàn)，G和H)8個(gè)不同的亞基構(gòu)成，主要負(fù)責(zé)ATP的水解[8,9]。V0部分則位于跨膜區(qū)，是一個(gè)260 ku的復(fù)合體，由(a、d、e、c、c′、c″)6個(gè)不同的亞基組成，主要負(fù)責(zé)質(zhì)子的轉(zhuǎn)移[10]。在骨吸收的過(guò)程中，破骨細(xì)胞先貼附于骨表面，形成相對(duì)隔絕的細(xì)胞外骨吸收微環(huán)境，然后在酸性條件下溶解骨礦物質(zhì)，繼而降解骨基質(zhì)成分[11]。研究發(fā)現(xiàn)，V-ATP酶以高密度在特定的細(xì)胞膜中表達(dá)，如腎閏細(xì)胞和破骨細(xì)胞等，它們?cè)谀蛞核峄?、破骨?xì)胞的骨吸收中發(fā)揮著重要的作用[12]。破骨細(xì)胞分泌氫離子溶解羥基磷灰石晶體是骨骼脫鈣的重要環(huán)節(jié)，其中，破骨細(xì)胞膜上的V-ATP酶參與氫離子分泌這一關(guān)鍵生理過(guò)程[7,13]。研究表明，V-ATP酶缺陷是患骨硬化病的常見(jiàn)原因[14]。本研究觀察TNF-α對(duì)破骨細(xì)胞上V-ATP酶表達(dá)量的影響，可以了解TNF-α對(duì)提高破骨細(xì)胞骨吸收活性的機(jī)制。

破骨細(xì)胞作為終末細(xì)胞不能增殖和傳代，以往獲得破骨細(xì)胞的方法是提取鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，然后誘導(dǎo)分化得到破骨細(xì)胞，這種方法難以獲取大量高純度破骨細(xì)胞。故本實(shí)驗(yàn)選用誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞RAW264.7向破骨細(xì)胞分化。結(jié)果顯示，50 ng/mLRANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞，6天后可獲得大量成熟的破骨細(xì)胞，且TRAP染色呈陽(yáng)性。

V-ATP酶在破骨細(xì)胞中表達(dá)量的增加可導(dǎo)致破骨細(xì)胞骨吸收活性的提高。本研究表明不同濃度的TNF-α作用于破骨細(xì)胞后，低、中、高濃度組破骨細(xì)胞上V-ATP酶mRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，且呈一定的劑量依賴性；同時(shí)，TNF-α干預(yù)組破骨細(xì)胞上V-ATP酶的蛋白表達(dá)量也顯著高于對(duì)照組。此外，本研究還用不同濃度TNF-α抗體來(lái)干預(yù)破骨細(xì)胞，觀察破骨細(xì)胞上V-ATP酶mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明TNF-α抗體可抑制破骨細(xì)胞上V-ATP酶mRNA和蛋白的表達(dá)，且呈一定的劑量依賴性。由此推測(cè)TNF-α作為一個(gè)炎癥遞質(zhì)參與骨吸收的過(guò)程中，除了促進(jìn)破骨細(xì)胞形成以外，其可能還通過(guò)增加破骨細(xì)胞上V-ATP酶的表達(dá)，從而增強(qiáng)破骨細(xì)胞的骨吸收活性。