柵藻作為生物指示劑的生物延遲發(fā)光研究*

張玉風，楊美娜，龐靖祥，周寶宸，韓金祥△

(1.濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東 濟南 250020； 2.山東省醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東 濟南 250062)

1 引 言

生物光子輻射又稱超微弱發(fā)光，是生命系統(tǒng)的本質(zhì)現(xiàn)象，存在于各種動物、植物、藻類及微生物系統(tǒng)中，是生命新陳代謝的產(chǎn)物，來自生物分子從高能態(tài)向低能態(tài)的躍遷[1]，是一個典型的量子效應。大量實驗結(jié)果表明，生物光子輻射可以反映生物系統(tǒng)內(nèi)部的微觀信息及外界環(huán)境的微弱變化，且具有很高的靈敏度[2]。生物光子輻射包括自發(fā)發(fā)光和延遲發(fā)光，延遲發(fā)光是指一個生物系統(tǒng)被光照射后的長時間遲豫現(xiàn)象，其遲豫動力學過程不可用指數(shù)函數(shù)描述[3]，延遲發(fā)光作為一種特殊的生物光子輻射，被認為是反映生物系統(tǒng)內(nèi)部狀態(tài)的一個指標[4-5]。

有報道稱[6]，通過檢測加入生物指示劑(一種標準的生物發(fā)光樣品)的水的延遲發(fā)光行為可以獲得關(guān)于水質(zhì)量與水污染的信息。柵藻是一種極喜在營養(yǎng)豐富的靜水中繁殖的淡水單細胞綠藻，對除草劑等農(nóng)藥十分敏感[7]，常用于重金屬對藻類的毒性研究中[8-11]，可敏感感知不同液體環(huán)境，快速、高效區(qū)分多種水質(zhì)污染，常用作水質(zhì)評價的指示生物?；诖?，本研究選用柵藻作為生物指示劑，探索其最優(yōu)使用條件，并探討加入不同中藥煎煮液的柵藻延遲發(fā)光動力學行為演化，為用柵藻作為生物指示劑來研究中藥藥性奠定基礎(chǔ)。

2 材料和方法

2.1 材料

生物指示劑：柵藻(Scenedesmus sp.) 購自中國科學院武漢水生生物研究所 (編號FACHB-933)，使用BG11培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

主要儀器設(shè)備：YPMS-2生物光子測量儀，UV-2802型紫外可見分光光度計，GXZ智能光照培養(yǎng)箱，超凈工作臺，MLS-3780高壓滅菌鍋，尚朋堂電陶爐，康舒砂鍋，石英比色皿，ACCULAB電子天平，錐形瓶，燒杯，量筒，離心管，移液槍。

2.2 方法

2.2.1柵藻濃度的優(yōu)化 本研究選用光密度法測定柵藻濃度。測量波長為680 nm，柵藻的吸光度A與細胞濃度C的線性回歸方程為C=(A×11.995+0.1502)×106個/ml (R2=0.9766)[12-13]，根據(jù)測得的柵藻吸光度，計算出柵藻的濃度。

選取生長狀態(tài)良好的柵藻，搖勻，分別取適量藻液置于16個15 mL離心管中，加入適量BG11培養(yǎng)基稀釋，得到吸光度為1～3的藻液。分別取3 mL藻液置于4 cm×1 cm×1 cm的石英比色皿中，放于YPMS-2生物光子測量儀的暗室內(nèi)，測其自然延遲(點間隔0.1 s，測量時間5 min)及激發(fā)延遲(點間隔0.1 s，測量時間5 min，激發(fā)光源為White-LED，激發(fā)時間為10 s，重復測量7次，兩次測量間隔20 min)。

2.2.2柵藻生長階段的優(yōu)化 分別選取生長至16、21、30、40、51、60、70 d的生長狀態(tài)良好的柵藻，均調(diào)節(jié)至柵藻液的吸光度為2.5，取3 mL置于4×1×1 cm的石英比色皿中，放于YPMS-2生物光子測量儀的暗室內(nèi)，測其自然延遲及激發(fā)延遲，每個生長階段的柵藻平行測定3次以減少測量誤差。

自然延遲參數(shù)設(shè)置：點間隔0.1 s，測量時間15 min；激發(fā)延遲參數(shù)設(shè)置：點間隔0.1 s，測量時間5 min，激發(fā)光源為White-LED，激發(fā)時間10 s，重復測量7次，兩次測量間隔20 min。

2.2.3加入中藥煎煮液的柵藻延遲發(fā)光測量 本研究選用黃連和吳茱萸2味中藥進行初步研究。

(1)中藥煎煮液的制備[14]

用電子天平秤取中藥材10 g，置于砂鍋中，加入200 mL水浸泡30 min，用電陶爐加熱，功率調(diào)至2000 W，煮沸后調(diào)至800 W，共煎煮15 min，用6層紗布過濾藥液，藥渣重復上述煎煮流程，將2次煎煮的藥液合并濃縮，放涼至室溫，最終得中藥煎煮液50 mL。

(2)中藥煎煮液的延遲發(fā)光測量

選取生長40 d的狀態(tài)良好的柵藻，調(diào)至吸光度為2.5，取3 mL置于4 ×1×1 cm的石英比色皿中，分別加入中藥煎煮液20、40、60、80、100 μL，迅速放于YPMS-2生物光子測量儀的暗室內(nèi)，5 min后測其激發(fā)延遲。

激發(fā)延遲參數(shù)設(shè)置：點間隔0.1 s，測量時間5 min，激發(fā)光源為White-LED，激發(fā)時間10 s，重復測量7次，兩次測量間隔20 min。

2.2.4數(shù)據(jù)處理分析 本研究采用“顧參數(shù)”模型對數(shù)據(jù)進行分析處理?！邦檯?shù)”模型運用了量子光學理論和非平衡統(tǒng)計物理的概念，可以對延遲發(fā)光數(shù)據(jù)進行很好的擬合。目前已被發(fā)現(xiàn)其能夠刻畫許多不同生物樣品延遲發(fā)光的實驗結(jié)果，如動物組織、種子、食品、水藻、微生物系統(tǒng)、甚至化妝品等[15]。

將測得的延遲發(fā)光數(shù)據(jù)導入Statistica 10.0軟件，擬合公式編輯為顧參數(shù)公式

I(t)=Acsch2(t/B+C)

(1)

得到3個擬合參數(shù)，即“顧參數(shù)”A、B、C，然后帶入平均強度的計算公式

IW=AB/W[coth C-coth(W/B+C)]

(2)

得到每次延遲發(fā)光的輻射強度在總的測量時間W內(nèi)的平均值即平均強度，然后將7次激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度IW與時間t進行線性擬合得到線性擬合方程IW=kt+b，其中斜率k扮演了刻畫樣品性質(zhì)的可靠參數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 柵藻濃度的優(yōu)化

將理論結(jié)果式(1)與柵藻的實際延遲發(fā)光數(shù)據(jù)相比較，見圖1、圖2，自然延遲發(fā)光和激發(fā)延遲發(fā)光的理論值與觀察值均有相當好的擬合，相關(guān)系數(shù)分別為0.9982和0.9863，說明 “顧參數(shù)”模型是處理延遲發(fā)光數(shù)據(jù)的可靠模型，具有相當高的精確性。

圖1柵藻自然延遲的理論值與觀察值的線性相關(guān)(A=2.483)

Fig1Linearcorrelationbetweenthescenedesmusnaturaldelaytheoreticalandobservedvalue(A=2.483)

圖2柵藻激發(fā)延遲的理論值與觀察值的線性相關(guān)(A=2.483)

Fig2Linearcorrelationbetweenthescenedesmusexcitationdelaytheoreticalandobservedvalue(A=2.483)

表1給出了不同濃度柵藻的自然延遲發(fā)光平均強度及7次激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對時間的線性擬合斜率k及擬合度R2。我們發(fā)現(xiàn)，自然延遲發(fā)光的平均強度基本上隨柵藻濃度的增大而增大(見圖3)，激發(fā)延遲發(fā)光的斜率k和擬合度R2在柵藻濃度低于2.5×107個/mL時波動較大，在2.5～3.5×107個/mL濃度范圍內(nèi)較穩(wěn)定(見圖4)，因此,我們選定柵藻使用的濃度范圍為2.5～3.5×107個/mL?？紤]到柵藻的培養(yǎng)周期及使用量，實驗中我們選用的柵藻濃度為3.0×107個/mL，即調(diào)節(jié)柵藻的吸光度為2.5。

表1不同濃度柵藻延遲發(fā)光的參數(shù)對比

Table1Thecontrastofdelayedluminescenceparametersofdifferentconcentrationsofscenedesmus

編號柵藻吸光度柵藻濃度(107個/ml)自然延遲平均強度激發(fā)延遲線性擬合k線性擬合R210.9591.165645.0582.2640.95521.0751.3051272.8894.9140.98031.2881.5601033.4120.9020.79541.3831.6741310.6071.0070.74051.4911.8041079.6313.8690.96161.6061.9411820.9650.3740.24371.7052.0601607.0268.2310.98581.8782.2681360.8629.7050.99892.0292.4492125.9462.3640.799102.1012.5351798.5856.0770.989112.2232.6821764.3815.8290.944122.3092.7851828.3316.6850.976132.4832.9931700.7466.3780.953142.6793.2292057.6846.1890.916152.8853.4761929.1736.0100.986163.0143.6302201.4387.7010.952

圖3柵藻自然延遲平均強度隨柵藻濃度的變化

Fig3Scenedesmusnaturaldelayaverageintensityalongwiththechangeofalgalcellsconcentration

圖4柵藻激發(fā)延遲斜率及擬合度隨柵藻濃度的變化

Fig4Scenedesmusexcitationdelayslopeandfittingdegreealongwiththechangeofalgalcellsconcentration

3.2 柵藻生長階段的優(yōu)化

本研究測定了7個生長階段的柵藻的自然延遲發(fā)光，并計算了其平均強度。見圖5，生長70 d的柵藻自然延遲發(fā)光的平均強度較其他幾組較低，且與生長21、30、51、60 d的柵藻自然延遲發(fā)光平均強度相比有統(tǒng)計學差異。除生長70 d的柵藻，其余各組兩兩比較均無顯著性差異。

圖5不同生長階段柵藻自然延遲平均強度對比

Fig5Thecontrastofscenedesmusnaturaldelayaverageintensityindifferentgrowthstages

圖6給出了7個生長階段的柵藻7次激發(fā)延遲發(fā)光的平均強度對測量時間的線性擬合斜率k，可以看出，生長16～30 d的柵藻k值較高，且組間無顯著性差異，生長40～70 d的柵藻k值較低，組間無顯著性差異，生長16、21、30 d的任意一組柵藻與生長40、51、60、70 d的任意一組柵藻兩兩比較均有顯著性差異。

圖6不同生長階段柵藻激發(fā)延遲k值對比

Fig6Thecontrastofscenedesmusexcitationdelaykvalueindifferentgrowthstages

生物光子輻射能夠反映系統(tǒng)內(nèi)部新陳代謝的狀態(tài)，隨著柵藻培養(yǎng)時間的延長，細胞的生命力減弱，表現(xiàn)為k值的降低。但考慮到柵藻的使用濃度較高時k值較為穩(wěn)定，生長70 d的柵藻自然延遲平均強度較低，第七次激發(fā)延遲初始強度較高，故本研究選用柵藻使用的最佳生長階段為40～60 d。

3.3 加入中藥煎煮液的柵藻延遲發(fā)光測量

本研究選擇了黃連、吳茱萸進行中藥煎煮液延遲發(fā)光的初步研究。圖7、圖8分別給出了加入不同體積黃連、吳茱萸煎煮液的柵藻7次激發(fā)延遲發(fā)光平均強度對時間的線性擬合斜率k和擬合度R2，從圖中可以看出，加藥體積為20 μL時擬合度最高，加入黃連煎煮液的柵藻k值低于加入?yún)擒镙羌逯笠旱臇旁錵值，加入20 μL的吳茱萸煎煮液的柵藻k值約為加入20 μL的黃連煎煮液的柵藻k值的3倍。本實驗結(jié)果說明檢測加入中藥煎煮液的柵藻延遲發(fā)光時，中藥煎煮液加入的最適體積為20 μL；柵藻對其所處的液體環(huán)境非常敏感，k值可反映柵藻所處液體環(huán)境的差異。

圖7加入不同體積黃連煎煮液的柵藻激發(fā)延遲斜率和擬合度對比

Fig7ThecontrastofscenedesmusexcitationdelayslopeandfittingdegreeafteraddingdifferentvolumeofCoptidisrhizomadecoctionfluid

圖8加入不同體積吳茱萸煎煮液的柵藻激發(fā)延遲斜率和擬合度對比

Fig8ThecontrastofscenedesmusexcitationdelayslopeandfittingdegreeafteraddingdifferentvolumeofEuodiaefructusdecoctionfluid

4 結(jié)論

本研究主要研究了柵藻的延遲發(fā)光，并對其使用條件進行優(yōu)化，主要得到如下結(jié)論：

(1)通過檢測不同濃度柵藻的延遲發(fā)光，我們發(fā)現(xiàn)，柵藻激發(fā)延遲發(fā)光的k值在2.5～3.5×107個/mL濃度范圍內(nèi)較穩(wěn)定，為了減少誤差，實驗中我們選用同等濃度的柵藻，其濃度為3.0×107個/mL，即調(diào)節(jié)柵藻的吸光度為2.5。

(2)柵藻在不同的生長階段，延遲發(fā)光會有所不同。通過對不同生長階段柵藻自然延遲發(fā)光平均強度、第7次激發(fā)延遲發(fā)光的初始強度、7次激發(fā)延遲發(fā)光k值的綜合分析，實驗選用生長40～60 d柵藻。

(3)通過檢測不同中藥煎煮液對柵藻延遲發(fā)光的影響，我們選定中藥煎煮液加入的最適體積為20 μL；同時，我們發(fā)現(xiàn)加入不同中藥煎煮液的柵藻k值有較大差異。

韓金祥等[16-17]基于生物光子相干理論提出中藥藥性量子假說，提出機體電磁輻射(量子)可以表征中醫(yī)之氣，四氣是調(diào)節(jié)機體電磁輻射量子疊加態(tài)的度量，通過檢測不同藥性中藥生物光子輻射行為的差異，可從整體上獲得表征中藥藥性的生物光子量化指標。本研究在優(yōu)化柵藻使用條件的基礎(chǔ)上，檢測了加入不同中藥煎煮液的柵藻激發(fā)延遲發(fā)光行為，發(fā)現(xiàn)其k值有較大差異。黃連和吳茱萸的寒熱藥性不同，加入柵藻中后，改變了柵藻所處的液體環(huán)境，從而改變了柵藻的生命狀態(tài)，表現(xiàn)為其動力學行為的變化，而這種變化可由k值刻畫。由此我們構(gòu)想，用柵藻作為生物指示劑，檢測其加入不同藥性中藥煎煮液后的延遲發(fā)光行為，其k值用于表征不同藥性中藥的差異。當然，這只是我們基于實驗結(jié)果的猜想，還需要大量數(shù)據(jù)的驗證，但這為中藥藥性的研究提供了新的方向。