賈寒，龐靖祥，楊美娜，張玉風(fēng)，韓金祥△

（1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250020；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南250062）

1 引 言

任何有生命的物質(zhì)都會(huì)自發(fā)的向外輻射光子，這種現(xiàn)象稱為生物光子輻射，其波長范圍在200～800 nm，強(qiáng)度很弱，大約幾到幾百個(gè)光子/s·cm2，但是它攜帶著豐富的生命信息，能提供有機(jī)體代謝及功能轉(zhuǎn)化的重要信息［1］。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生物光子輻射存在于所有的生物系統(tǒng)之中，是一種普遍的生命現(xiàn)象。生物光子輻射對生物系統(tǒng)內(nèi)部及外界環(huán)境的變化具有高度靈敏性，所以，可以通過對生命系統(tǒng)的生物光子輻射的檢測和研究，來獲得豐富的生命信息，從而了解生命系統(tǒng)內(nèi)外界環(huán)境的微弱變化。

水體中的藻類對污染毒物非常敏感.而且種類繁多.可以生存在不同類型的水體以及水體的不同生境之中，所以其可作為監(jiān)測水質(zhì)變化的測試生物［2］。柵藻是淡水中常見的浮游藻類，在水質(zhì)評價(jià)中可作為指示生物，且斜生柵藻等又極易進(jìn)行大量人工培養(yǎng)，故柵藻常常作為研究水體污染的一種很好的實(shí)驗(yàn)材料［3-4］。綜上所述，柵藻對其所處的環(huán)境非常敏感，在不同的水環(huán)境中其生物學(xué)行為會(huì)有所不同，因而，其生物光子輻射行為也會(huì)存在差異。本研究以柵藻為實(shí)驗(yàn)對象，利用YPMS-2生物光子測量儀對加入中藥生地黃后的柵藻生物光子輻射行為進(jìn)行探索研究。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 主要儀器設(shè)備 光電倍增管（9558QB），樣品室，光源裝置，高壓電源，制冷系統(tǒng)，光子計(jì)數(shù)器，數(shù)據(jù)采集卡，UV-2802型紫外可見分光光度計(jì)，恒溫光照培養(yǎng)箱，滅菌鍋，電陶爐，砂鍋。

2.1.2 供試生物 柵藻（Scenedesmus sp.）自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所采購（編號(hào)FACHB-933），使用BG11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 方法

2.2.1 柵藻的培養(yǎng) 選取生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的柵藻，將其接入滅菌的玻璃三角瓶（500 ml）中，加入BG11培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)定溫度為25℃，光照強(qiáng)度為4 000 Lux，光暗比為12∶12 h，每天手工搖瓶2～3次，培養(yǎng)20天，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接比例為 1∶5（藻液：BG11培養(yǎng)基）［5-6］。按上述方法培養(yǎng)一段時(shí)間，選擇長勢良好的柵藻進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 柵藻濃度的測定 測定藻類生物量的方法一般有光密度測量法、顯微直接計(jì)數(shù)法、葉綠素a含量測定法等，相較之下，光密度法易于操作，測量過程方便快捷，重復(fù)性較高，因此本研究選用光密度法測定柵藻濃度。

混勻藻液，用移液槍吸取3 ml置于4 cm×1 cm×1 cm的石英比色杯中，使用紫外可見分光光度計(jì)在波長680 nm處測量藻液的吸光度值。通過藻液的吸光度A與細(xì)胞密度Y的線性回歸方程：C=（A*11.995+0.1502）*106個(gè)/ml（R2=0.9766）［7］，根據(jù)測得的藻液吸光度值，計(jì)算出藻液的濃度。

2.2.3 中藥湯劑的制備 頭煎：取10 g生地黃，加200 ml水，浸泡半小時(shí)，先用武火煎煮，煮沸后改用文火，共煎煮15 min。濾出藥渣用于二煎，保留藥液。二煎：將頭煎的藥渣加水200 ml，煎煮20 min，濾出藥渣，保留藥液。將兩次煎煮的藥液合并，用濾紙?jiān)俅芜^濾并放涼至室溫，最終得到生地黃湯劑50 ml。

2.2.4 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 提前2 h打開溫濕度控制系統(tǒng)，設(shè)定室溫為20℃，室內(nèi)濕度50%。打開YPMS-2生物光子測量儀，設(shè)置儀器的工作電壓為1252 V，待制冷系統(tǒng)將溫度降至-23℃，測量儀器的本底噪聲。

2.2.5 測量生地黃湯劑的生物光子輻射 用移液槍吸取3 ml生地黃湯劑置于4 cm×1 cm×1 cm的石英比色杯中，混勻，然后迅速放入樣品室，測量其自發(fā)發(fā)光、延遲發(fā)光。

2.2.6 測量BG11培養(yǎng)基與柵藻的生物光子輻射 取3 mlBG11培養(yǎng)基置于石英比色杯中，放入樣品室，測量其自發(fā)發(fā)光及延遲發(fā)光。取3 ml藻液置于石英比色杯中，用紫外可見分光光度計(jì)測其吸光度，放入樣品室中暗適應(yīng)15 min，測量其自發(fā)發(fā)光及延遲發(fā)光。

2.2.7 測量加入不同體積生地黃的柵藻自發(fā)發(fā)光 選取長勢良好的柵藻，測其吸光度，從中取樣11份置于石英比色杯中，每份3 ml，分別加入11個(gè)不同體積（0、50、110、170、230、290、350、410、470、530、590 ul）的生地黃湯劑于藻液中，并將其混勻放入樣品室中，暗適應(yīng)15 min，測量其自發(fā)發(fā)光。

2.2.8 測量加入不同體積生地黃的柵藻延遲發(fā)光延遲發(fā)光是生物系統(tǒng)受光照射后發(fā)生的長時(shí)間超微弱發(fā)光弛豫的現(xiàn)象，是生物超微弱發(fā)的重要組成部分，被認(rèn)為是反映生物系統(tǒng)內(nèi)部狀態(tài)的一種指標(biāo)［7-8］。選取一瓶長勢良好的柵藻，測其吸光度，在該瓶柵藻中取樣11次，每次3 ml，分別置于10個(gè)石英比色杯中，向每個(gè)樣品里依次加入生地黃湯劑 0、50、110、170、230、290、350、410、470、530、590 ul，并將其混勻放入樣品室中，暗適應(yīng)15 min，測量其延遲發(fā)光。

2.2.9 數(shù)據(jù)處理分析 將得到的數(shù)據(jù)輸入originpro 2015軟件中，分別對以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 生地黃湯劑與柵藻液的生物光子輻射比較

為了排除生地黃湯劑自身發(fā)光對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，因而對生地黃湯劑的生物光子輻射進(jìn)行測量。依次檢測儀器本底噪聲、湯劑的自發(fā)發(fā)光、延遲發(fā)光以及藻液的自發(fā)發(fā)光、延遲發(fā)光，由于白光包含全波段光譜，激發(fā)對象后產(chǎn)生的延遲發(fā)光將包含生物系統(tǒng)的全面信息，因此激發(fā)光源選擇白光，激發(fā)時(shí)間為10 s。如圖1所示，儀器噪聲的平均光子數(shù)為11.07個(gè)/s，生地黃湯劑自發(fā)發(fā)光平均光子數(shù)為13.22個(gè)/s，柵藻自發(fā)發(fā)光平均光子數(shù)為22.9個(gè)/s。從圖中可以看出，柵藻的自發(fā)發(fā)光光子數(shù)明顯高于儀器噪聲和生地黃湯劑，而生地黃湯劑的自發(fā)發(fā)光光子數(shù)與噪聲相近，因此與柵藻的自發(fā)發(fā)光相比，生地黃湯劑的自發(fā)發(fā)光可以忽略不計(jì)。

圖1 生地黃湯劑與柵藻的自發(fā)發(fā)光對比Fig 1 Comparison of Radix Rehmannia Decoction and the spontaneous luminescence of Scenedesmus

圖2為生地黃湯劑的延遲發(fā)光衰減曲線，可以看出其第1 s的延遲發(fā)光光子數(shù)為59個(gè)/s，隨后則直接衰減至自發(fā)狀態(tài)（平均光子數(shù)為13個(gè)/s），呈指數(shù)衰減。圖3是生地黃與柵藻延遲發(fā)光的衰減曲線，通過對比可以發(fā)現(xiàn)，與柵藻的延遲發(fā)光相比較而言，生地黃的延遲發(fā)光幾乎可以忽略不計(jì)，綜上所述，可以排除實(shí)驗(yàn)過程中生地黃湯劑自身的生物光子輻射對結(jié)果的影響，加入生地黃湯劑的柵藻的生物光子輻射即為其自身的發(fā)光。

圖2 生地黃湯劑的延遲發(fā)光曲線Fig 2 The delayed luminescence curve of Radix Rehmanniae Decoction

圖3 生地黃湯劑與柵藻的延遲發(fā)光對比Fig 3 Comparison of delayed luminescence of Radix Rehmannia Decoction and Scenedesmus

3.2 BG11培養(yǎng)基與柵藻液的生物光子輻射比較

BG11培養(yǎng)基是一種無菌水溶液，主要由無機(jī)鹽NaNO3、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、ZnSO4等組成，為了排除培養(yǎng)基自身發(fā)光對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，分別測量了BG11培養(yǎng)基的自發(fā)發(fā)光及柵藻的自發(fā)發(fā)光，結(jié)果見圖4。由圖中可以看出，BG11培養(yǎng)基的自發(fā)發(fā)光光子數(shù)與噪聲的光子數(shù)非常相近，而藻液的自發(fā)發(fā)光光子數(shù)明顯高于前二者。通過計(jì)算，儀器噪聲的平均光子數(shù)為11.07，BG11培養(yǎng)基的自發(fā)發(fā)光平均光子數(shù)為11.91，藻液的自發(fā)發(fā)光平均光子數(shù)為22.9，前二者的光子數(shù)近似相等，因此培養(yǎng)基的自發(fā)發(fā)光可以忽略不計(jì)，藻液的自發(fā)發(fā)光即為柵藻本身的自發(fā)發(fā)光。

圖4 BG11培養(yǎng)基與柵藻的自發(fā)發(fā)光對比Fig 4 Comparison of spontaneous emission of BG11 medium and Scenedesmus

圖5為BG11培養(yǎng)基的延遲發(fā)光衰減曲線，其光子數(shù)由50多個(gè)在1 s后直接衰減至自發(fā)狀態(tài)，延遲發(fā)光曲線呈指數(shù)衰減。通過培養(yǎng)基與藻液延遲發(fā)光曲線的對比（見圖6），可以發(fā)現(xiàn)與柵藻的延遲發(fā)光相比，培養(yǎng)基的延遲發(fā)光幾乎可以忽略不計(jì)，綜上所述，可以排除實(shí)驗(yàn)過程中BG11培養(yǎng)基自身的生物光子輻射對柵藻的影響，認(rèn)為藻液的生物光子輻射即為柵藻本身的生物光子輻射。

圖5 BG11培養(yǎng)基的延遲發(fā)光曲線Fig 5 Delayed luminescence curve of BG11 medium

圖6 BG11培養(yǎng)基與柵藻的延遲發(fā)光對比Fig 6 Comparison of delayed luminescence between BG11 medium and Scenedesmus

3.3 加入不同體積生地黃湯劑對柵藻自發(fā)發(fā)光的影響

選取對數(shù)生長期的柵藻，測其吸光度A=1.27，根據(jù)公式 C=（A×11.995+0.1502）×106個(gè)/ml（R2=0.9766）算出藻液的濃度為1.5×107個(gè)/ml，然后取11個(gè)樣，每個(gè)3 ml，分別向其中加入不同體積的生地黃湯劑，依次測量柵藻的自發(fā)發(fā)光，計(jì)算其平均光子數(shù)，結(jié)果見表1。儀器噪聲10.9，藻液的自發(fā)平均光子數(shù)為22.9，隨著加入生地黃體積的增加，其自發(fā)平均光子數(shù)的變化趨勢是先增大后減小，最高值在350 ul處，光子數(shù)為42.5個(gè)/s，見圖7。當(dāng)加入湯劑的體積小于350 ul時(shí)，湯劑的加入體積與柵藻的自發(fā)光子數(shù)的關(guān)系呈正相關(guān)，將公式y(tǒng)=a+b×x（1）輸入originpro軟件中，把測得的柵藻自發(fā)發(fā)光數(shù)據(jù)與理論表達(dá)式（1）進(jìn)行最佳線性擬合，得到方程 y=27.35714+0.76113×x，R2=0.971，擬合的兩個(gè)參數(shù)a=27.35714，b=0.76113，擬合關(guān)聯(lián)度高達(dá)97.1%，見圖8。所以說在一定范圍內(nèi)，生地黃的加入體積與柵藻自發(fā)發(fā)光平均強(qiáng)度呈較好的線性關(guān)系。生地黃為一種常用中藥，性味甘寒，歸心、肝、腎三經(jīng)，功效：清熱涼血，養(yǎng)陰生津。根據(jù)以上數(shù)據(jù)分析可得，中藥生地黃可以使柵藻的自發(fā)發(fā)光呈現(xiàn)一種規(guī)律性的變化，并且在一定范圍內(nèi)二者會(huì)表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。

表1 不同體積的生地黃湯劑對應(yīng)的柵藻的自發(fā)發(fā)光平均光子數(shù)Table 1 The average photon of spontaneous emission in different volume of the Radix Rehmannia Decoction corresponding Scenedesmus

圖7 隨著生地黃湯劑體積增大的柵藻的自發(fā)發(fā)光平均強(qiáng)度Fig 7 With the volume increase of Radix Rehmannia Decoction，the average intensity of spontaneous luminescence of Scenedesmus

圖8 加入的生地黃體積（＜=350ul）與柵藻自發(fā)發(fā)光平均強(qiáng)度的線性擬合Fig 8 Linear fitting between the volume（＜=350ul）of Radix Rehmannia Decoction and the average intensity of spontaneous luminescence of Scenedesmus

3.4 加入不同體積生地黃湯劑對柵藻延遲發(fā)光的影響

圖9為柵藻延遲發(fā)光曲線的擬合，本文運(yùn)用“顧參數(shù)”模型對柵藻的延遲發(fā)光進(jìn)行分析，該參數(shù)的函數(shù)表達(dá)式為：I（t）=——（1），利用公式（1）對柵藻延遲發(fā)光曲線進(jìn)行擬合，可以得出A、B、C三個(gè)參數(shù)，即顧參數(shù)，然后再根據(jù)公式 I（0）=A×csch2C——（2）算出柵藻延遲發(fā)光的初始強(qiáng)度，結(jié)果見表2（藻液自身的延遲發(fā)光實(shí)測/計(jì)算初始強(qiáng)度分別為33165，30965）。隨著生地黃湯劑體積的增加，實(shí)測初始強(qiáng)度和計(jì)算初始強(qiáng)度均是先增大后減小，最高值在350 ul處，說明中藥生地黃對柵藻的延遲發(fā)光具有明顯的影響。柵藻延遲發(fā)光呈雙曲線衰減規(guī)律，說明生物系統(tǒng)內(nèi)的各個(gè)激發(fā)態(tài)分子之間是相互偶聯(lián)的，它們可能通過生物系統(tǒng)內(nèi)存在的電磁場互相聯(lián)系，而這正是相干場的重要特征［9-10］。電磁輻射相干性：一部分自發(fā)的和光誘導(dǎo)的生物超弱發(fā)光的光子（量子），起源于生物系統(tǒng)內(nèi)一個(gè)高度相干的電磁場，這種相干電磁場很可能是活組織內(nèi)通訊聯(lián)絡(luò)的基礎(chǔ)［11-13］，而恰恰可能是生物光子扮演著生物體內(nèi)一種新型通訊信使的角色［14］。

圖9 柵藻的延遲發(fā)光曲線Fig 9 The Delay luminescence curve of the Scenedesmus

表2 不同體積的生地黃對應(yīng)的柵藻的延遲發(fā)光初始強(qiáng)度Table 2 The initial intensity of delayed luminescence of Scenedesmus corresponding to different volumes of Radix Rehmannia Decoction

4 結(jié)論

（1）通過對儀器噪聲、生地黃湯劑與柵藻液生物光子輻射的對比分析，可以得出結(jié)論，生地黃湯劑自身并無生物光子輻射，這就排除了湯劑發(fā)光對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

（2）由BG11培養(yǎng)基與柵藻液的生物光子輻射的比較分析可知，培養(yǎng)基幾乎無發(fā)光，柵藻的生物光子輻射能力較強(qiáng)，其延遲發(fā)光的雙曲線規(guī)律為生物光子輻射的相干性理論提供了有力證據(jù)，這說明以柵藻作為指示劑具有可行性。

（3）根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出生地黃湯劑會(huì)對柵藻的生物光子輻射行為產(chǎn)生明顯的影響，其對柵藻自發(fā)發(fā)光平均強(qiáng)度與延遲發(fā)光初始強(qiáng)度的影響趨勢均表現(xiàn)為先增大后減小，發(fā)光強(qiáng)度的最高值在350 ul處。這說明中藥生地黃本身的固有性質(zhì)（即藥性）會(huì)改變柵藻的生物學(xué)行為，從而表現(xiàn)為柵藻生物光子輻射行為的變化。前期本課題組基于生物光子相干理論提出中藥藥性量子假說［15］，并認(rèn)為利用生物光子檢測技術(shù)，通過檢測不同藥性中藥生物光子輻射行為的差異，可從整體上獲得表征中藥藥性的生物光子量化指標(biāo)。柵藻作為一種常用的水質(zhì)指示生物，它可以對其周圍液體環(huán)境所發(fā)生的變化做出靈敏的反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示不同體積的中藥生地黃湯劑對柵藻生物發(fā)光行為影響不同，具體反映在柵藻生物光子輻射行為自發(fā)強(qiáng)度和延遲發(fā)光初始強(qiáng)度的變化上，這為后續(xù)利用柵藻生物光子輻射行為的差異來區(qū)分中藥藥性提供了實(shí)驗(yàn)支持。

綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)利用柵藻的生物光子輻射來區(qū)分中藥藥性具有較好的可行性。為柵藻作為中藥藥性的指示劑奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，也為將來相關(guān)課題的研究提供了依據(jù)。