劉曉惠 趙延欣 劉學(xué)源

中圖分類(lèi)號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）23-3178-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.03

摘 要 目的：體外研究姜黃素對(duì)高糖培養(yǎng)下大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6中抑癌基因p53、E3泛素連接酶Siah-1和認(rèn)知相關(guān)蛋白突觸素（Synaptophysin）表達(dá)的影響。方法：采用CCK-8法檢測(cè)10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L姜黃素在高糖培養(yǎng)下作用C6細(xì)胞24、48 h后的細(xì)胞存活率。采用Western blot法和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT- PCR）法檢測(cè)作用24 h后正常對(duì)照組（無(wú)任何處理）、高糖培養(yǎng)組和姜黃素低、高濃度組（高糖+10、30 μmol/L姜黃素）細(xì)胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白及mRNA的表達(dá)情況；另同法檢測(cè)高糖培養(yǎng)下小干擾RNA（siRNA）沉默C6細(xì)胞中p53基因后對(duì)Siah-1蛋白及mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：姜黃素在10～40 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)C6細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，大于40 μmol/L濃度后呈濃度依賴(lài)性降低細(xì)胞存活率。與正常對(duì)照組比較，高糖培養(yǎng)組C6細(xì)胞中p53、Siah-1蛋白及mRNA表達(dá)增強(qiáng)，Synaptophysin蛋白及mRNA表達(dá)減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與高糖培養(yǎng)組比較，姜黃素低、高濃度組C6細(xì)胞中p53、Siah-1蛋白及mRNA表達(dá)減弱，Synaptophysin蛋白及mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。高糖培養(yǎng)下，沉默p53基因后的C6細(xì)胞中Siah-1蛋白及mRNA表達(dá)均明顯減弱（P<0.05）。結(jié)論：高糖條件下，姜黃素可通過(guò)下調(diào)C6細(xì)胞中p53、Siah-1表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)Synaptophysin表達(dá)。

關(guān)鍵詞 姜黃素；高糖；p53；大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6；突觸素

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of curcumin on the expression of tumor suppressor gene p53， E3 ligase Siah-1 and cognitive associated protein Synaptophysin in glioma cells C6 of rats cultured in high glucose. METHODS： CCK-8 assay was used to detect survival rate of C6 cells after treated with 10， 20， 30， 40， 50， 60， 70， 80， 90， 100 μmol/L curcumin for 24， 48 h under high glucose environment. Western blot method and RT-PCR method were adopted to detect the protein and mRNA expressions of p53， Siah-1 and Synaptophysin in C6 cells of normal control group （without any treatment）， high glucose treatment group， curcumin low-concentration and high-concentration groups （high glucose+10， 30 μmol/L curcumin） after cultured for 24 h. Same method was used to determine the effects of P53 gene of C6 cells on protein and mRNA expression of Siah-1 after transfected with siRNA under high glucose environment. RESULTS： Curcumin had no significant effect on the survival rate of C6 cells in the range of 10-40 μmol/L. The survival rate of C6 cells decreased significantly in a concentration-dependent manner when the concentration of curcumin was higher than 40 μmol/L. Compared with normal control group， the protein and mRNA expressions of p53 and Siah-1 in C6 cells were enhanced in high glucose treatment group， while the protein and mRNA expressions of Synaptophysin were decreased， with statistical significance （P<0.05）. Compared with high glucose treatment group， the protein and mRNA expressions of p53 and Siah-1 in C6 cells were decreased in curcumin low-concentration and high-concentration groups， while the protein and mRNA expressions of Synaptophysin were enhanced， with statistical significance （P<0.05）. Under treated with high glucose， the protein and mRNA expressions of Siah-1 in C6 cells were decreased significantly after silencing p53 gene （P<0.05）. CONCLUSIONS： Under high glucose environment， curcumin can up-regulate the expression of Synaptophysin in C6 cells by down-regulating the expression of p53 and Siah-1.

KEYWORDS Curcumin； High glucose； p53； Glioma cells C6 of rats； Synaptophysin

姜黃素（Curcumin）是一種相對(duì)分子量較小的酚類(lèi)化合物，提取于姜科黃屬植物的根莖，是疏肝藥物郁金、姜黃、莪術(shù)中的主要活性成分。姜黃素具有抗腫瘤、抗炎、降血脂、降血糖的功效[1]，同時(shí)由于姜黃素含有阿魏酸鈉的活性成分，而后者在臨床上具有改善腦微循環(huán)、清除氧自由基、抗凋亡等作用，并且毒副作用小[2]，具有巨大的臨床應(yīng)用潛力。

糖尿病是認(rèn)知功能障礙發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，其與認(rèn)知功能障礙的發(fā)展有關(guān)。據(jù)報(bào)道，在65歲以上的住院患者中，約有26%患有糖尿病[3]。流行病學(xué)研究[4-5]和生物學(xué)證據(jù)[6-8]支持老年糖尿病患者更容易患各種類(lèi)型的癡呆癥[9]。同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，糖尿病可明顯減少海馬苔蘚纖維末梢和突觸小泡的數(shù)量，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的認(rèn)知功能下降[10]。本研究將以大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6為研究對(duì)象，通過(guò)體外模擬高糖環(huán)境重點(diǎn)探究不同濃度姜黃素對(duì)C6細(xì)胞中抑癌基因p53、E3泛素連接酶Siah-1和突觸素（Synaptophysin）表達(dá)的影響，以期為改善糖尿病患者的認(rèn)識(shí)功能障礙提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Genesys 10型紫外分光光度計(jì)、BB15型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；Microfuge 20R型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；TE22型蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）；聚丙烯酰胺垂直電泳系統(tǒng)（德國(guó)Biometra公司）；Elx800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）；Licor Odyssey型雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國(guó)Li-Cor公司）；2720型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（美國(guó)ABI公司）。

1.2 藥品與試劑

姜黃素對(duì)照品（貨號(hào)：458-37-7，純度：98%）、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、牛血清白蛋白（BSA）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（日本Dojindo公司）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）試劑盒和PrimeScript RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix試劑盒（北京普凱瑞生物科技有限公司）；兔抗Synaptophysin單克隆抗體（貨號(hào)：ab52636）、小鼠抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體 （貨號(hào)：ab6276）、山羊抗Siah-1多克隆抗體（貨號(hào)：ab131442）和兔抗p53多克隆抗體（貨號(hào)：sc-5505）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（美國(guó)Li-Cor公司）；磷酸酶抑制劑PhosStop（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：P0044，純度：98%）、RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、20×磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、苯甲基磺酰氟 （PMSF）均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Tris緩沖液、甘氨酸、脫脂奶粉、無(wú)水乙醇、甲醇均購(gòu)自上海生工生物有限公司；小干擾RNA（siRNA）委托上海領(lǐng)科生物有限公司構(gòu)建完成。

1.3 細(xì)胞

大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與給藥

取C6細(xì)胞，以含1%雙抗（青霉素、鏈霉素）、10%FBS、25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)為正常對(duì)照組；以含1%雙抗（青霉素、鏈霉素）、10%FBS、50 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，設(shè)為高糖培養(yǎng)組；取10 mg姜黃素溶于2.714 5 mL DMSO中得到濃度為10 mmol/L的母液，用培養(yǎng)基稀釋?zhuān)尤氲礁咛桥囵B(yǎng)3 d后的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使姜黃素終濃度分別達(dá)到10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L，分別作用24、48 h，設(shè)為姜黃素處理組。

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

按CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒操作方法，檢測(cè)“2.1”項(xiàng)下不同濃度姜黃素處理組作用24、48 h后細(xì)胞的存活率，根據(jù)結(jié)果篩選出不影響細(xì)胞存活率的姜黃素濃度和作用時(shí)間。細(xì)胞存活率（%）=[給藥組吸光度（OD值）-空白組OD值]/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%，其中對(duì)照組中不加姜黃素，空白組中不加姜黃素和C6細(xì)胞。

2.3 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白表達(dá)

將10 μL PMSF 加入至1 mL RIPA裂解液中配制成蛋白裂解液，分別裂解抽提“2.1”項(xiàng)下正常對(duì)照組、高糖培養(yǎng)組和姜黃素低、高濃度組（10、30 μmol/L）作用24 h后細(xì)胞中的總蛋白，以二喹啉甲酸（BCA）試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量，得到不同樣品的蛋白濃度后按照1 ∶ 6的比例加入6×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照總蛋白量?0 μg計(jì)算上樣量，用移液槍將適量蛋白樣品加入上樣孔，成功上樣后將電泳儀調(diào)至恒壓80 V，待溴酚藍(lán)指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，電泳儀調(diào)至恒壓120 V，至溴酚藍(lán)指示劑到凝膠底部，轉(zhuǎn)膜，置于一抗孵育液[小鼠抗β-actin單克隆抗體（1 ∶ 1 000）、山羊抗Siah-1多克隆抗體（1 ∶ 500）、兔抗p53多克隆抗體（1 ∶ 1 000）、兔抗Synaptophysin單克隆抗體 （1 ∶ 500）]中4 ℃孵育過(guò)夜，再置于兔抗IgG（1 ∶ 1 000）孵育液中4 ℃下孵育1 h，顯色曝光后分析條帶灰度值，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中p53、Siah-1、Synaptophysin mRNA表達(dá)

采用Trizol法分別提取正常對(duì)照組、高糖培養(yǎng)組、姜黃素處理組（10、30 μmol/L）作用24 h后細(xì)胞的總RNA，將總RNA沉淀5～10 min，溶于20 μL焦碳酸二乙酯（DEPC）水中。取溶解后的RNA 1 μL用DEPC水稀釋200倍后，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其260、280 nm波長(zhǎng)處的OD值，并計(jì)算OD260/OD280值，若OD260/OD280值在1.8～2.0之間表明滿(mǎn)足試驗(yàn)要求。將總RNA放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。采?PrimeScript RT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix試劑盒，將cDNA稀釋10倍后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系按說(shuō)明書(shū)操作。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)，結(jié)束后以mRNA的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度的變化值為縱坐標(biāo)繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔct進(jìn)行分析。ΔΔct=Δct（試驗(yàn)樣品）-Δct（基準(zhǔn)樣品）；Δct（試驗(yàn)樣品）=ct（試驗(yàn)組目的基因數(shù)值）-ct（試驗(yàn)組內(nèi)參基因數(shù)值）；Δct（基準(zhǔn)樣品）=ct（對(duì)照組目的基因數(shù)值）-ct（對(duì)照組內(nèi)參基因數(shù)值）。按照引物設(shè)計(jì)的原則，應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件，設(shè)計(jì)RT-PCR引物序列，該引物生成委托上海生工生物技術(shù)有限公司完成，引物序列見(jiàn)表1。

2.5 沉默p53對(duì)Siah-1的影響

試驗(yàn)分為正常對(duì)照組、高糖培養(yǎng)組、正常siRNA干擾組和高糖siRNA干擾組。細(xì)胞培養(yǎng)方法同“2.1”；siRNA沉默p53基因方法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C6細(xì)胞，胰酶消化后接種于6孔板中，接種時(shí)細(xì)胞密度為2.5×104 cm-2，在細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到30%～50%匯合度時(shí)行siRNA轉(zhuǎn)染，沉默p53基因。按Western blot法和RT-PCR法分別檢測(cè)3組細(xì)胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表達(dá)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料用x±s表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞存活率

10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L姜黃素作用24 h后C6細(xì)胞存活率分別為（98.120±0.69）%、（97.144±2.35）%、（92.876±2.08）%、（92.530±1.57）%、（84.636±0.54）%、（66.587±1.38）%、（56.740±1.75）%、（23. 521±1.59）%、（3.046±1.18）%、（2.879±0.23）%，經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)P<0.05，表明作用24 h時(shí)姜黃素濃度對(duì)C6細(xì)胞存活率有影響；作用48 h后C6細(xì)胞存活率分別為（91.381±1.03）%、（86.739±2.82）%、（85.478± 2.34）%、（77.318±3.66）%、（62.085±0.71）%、（58.214± 1.26）%、（43.619±3.65）%、（19.104±2.85）%、（6.067±4.63）%、（2.100±0.251）%，經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)P<0.05，表明作用48 h時(shí)姜黃素濃度對(duì)C6細(xì)胞存活率有影響。上述結(jié)果可以看出，姜黃素濃度為10～40 μmol/L時(shí)不會(huì)顯著降低C6細(xì)胞存活率，濃度大于40 μmol/L時(shí)，隨著作用濃度的升高，C6細(xì)胞存活率隨之降低，呈劑量依賴(lài)性；同時(shí)藥物作用時(shí)間24 h優(yōu)于48 h。不同濃度姜黃素對(duì)細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖1。

3.2 細(xì)胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，高糖培養(yǎng)組細(xì)胞中p53、Siah-1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，Synaptophysin蛋白表達(dá)明顯減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與高糖培養(yǎng)組比較，姜黃素低、高濃度組細(xì)胞中p53、Siah-1蛋白表達(dá)明顯減弱，Synaptophysin蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組細(xì)胞中p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖2，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

3.3 細(xì)胞中p53、Siah-1、Synaptophysin mRNA表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，高糖培養(yǎng)組細(xì)胞中p53、Siah-1 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，Synaptophysin mRNA表達(dá)明顯減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與高糖培養(yǎng)組比較，姜黃素低、高濃度組細(xì)胞中p53、Siah-1 mRNA表達(dá)明顯減弱，Synaptophysin mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組細(xì)胞中p53、Siah-1、Synaptophysin mRNA表達(dá)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

3.4 siRNA沉默p53基因后對(duì)Siah-1的影響

3.4.1 正常培養(yǎng) 與正常對(duì)照組比較，正常siRNA干擾組細(xì)胞中p53 蛋白和mRNA表達(dá)均明顯減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示siRNA干擾組成功沉默p53基因。正常條件下siRNA干擾后細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖5，p53蛋白及mRNA表達(dá)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。

3.4.2 高糖培養(yǎng) 與正常對(duì)照組比較，高糖培養(yǎng)組細(xì)胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P<0.05）。與高糖培養(yǎng)組比較，高糖siRNA干擾組細(xì)胞中p53、Siah-1蛋白及mRNA表達(dá)均明顯減弱（P<0.05）。提示沉默p53基因可明顯抑制高糖培養(yǎng)下C6細(xì)胞中Siah-1蛋白及mRNA表達(dá)的增強(qiáng)。高糖條件下siRNA干擾后細(xì)胞中p53、Siah-1蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖7，p53、Siah-1蛋白及mRNA表達(dá)的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8。

4 討論

Synaptophysin是突觸小泡中的主要蛋白質(zhì)，在整個(gè)大腦的神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中普遍存在，并被證明與認(rèn)知功能密切相關(guān)[11]。突觸傳遞過(guò)程是認(rèn)知功能表達(dá)的重要環(huán)節(jié)，Synaptophysin作為突觸的特異性標(biāo)記，已有研究證實(shí)其參與了神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸可塑性、突觸小泡形成以及再利用的過(guò)程，涉及學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知方面[12-13]，同時(shí)在糖尿病認(rèn)知功能障礙的動(dòng)物模型中可以觀察Synaptophysin的表達(dá)下降[14]。研究表明，Siah-1是降解Synaptophysin的主要蛋白酶，在神經(jīng)元中主要通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解[15]。

在本研究中，筆者體外模擬高血糖癥模型培養(yǎng)大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6，探討高糖條件下姜黃素對(duì)認(rèn)知保護(hù)蛋白Synaptophysin的調(diào)節(jié)作用，并探討了其相關(guān)作用機(jī)制。筆者將姜黃素配制成10～100 μmol/L的溶液，分別加入到高糖培養(yǎng)3 d后的C6細(xì)胞模型中，分別作用24、48 h，采用CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，姜黃素濃度為10～40 μmol/L時(shí)不會(huì)顯著降低細(xì)胞存活率，同時(shí)藥物作用時(shí)間24 h優(yōu)于48 h，所以后續(xù)試驗(yàn)選取了10、30 μmol/L作為姜黃素的實(shí)驗(yàn)濃度，24 h作為作用時(shí)間。這一結(jié)果說(shuō)明姜黃素的藥物濃度在較小的一定范圍內(nèi)不會(huì)對(duì)細(xì)胞活性造成損傷，但超過(guò)一定的濃度范圍，會(huì)顯著降低細(xì)胞存活率，對(duì)細(xì)胞活性造成損傷。相同藥物濃度下作用48 h后的細(xì)胞存活率依次低于作用24 h的細(xì)胞存活率，表明藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞存活率損傷越大。通過(guò)對(duì)p53、Siah-1、Synaptophysin蛋白和mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果提示，高糖培養(yǎng)3 d后細(xì)胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)，同時(shí)Synaptophysin蛋白和mRNA表達(dá)均明顯減弱；之后姜黃素作用24 h后細(xì)胞中p53、Siah-1蛋白和mRNA表達(dá)均明顯減弱，同時(shí)Synaptophysin蛋白和mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)。為了進(jìn)一步研究姜黃素是否是通過(guò)調(diào)控p53、Siah-1進(jìn)而上調(diào)Synaptophysin的，本文還構(gòu)建了p53基因沉默C6細(xì)胞，結(jié)果顯示，高糖siRNA干擾組細(xì)胞中Siah-1基因也隨之下調(diào)，提示高糖條件誘導(dǎo)沉默p53可抑制Siah-1上調(diào)，進(jìn)而介導(dǎo)泛素化降解Synaptophysin，使Synaptophysin表達(dá)上調(diào)。

綜上所述，高糖條件下，姜黃素可通過(guò)下調(diào)C6細(xì)胞中p53、Siah-1表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)Synaptophysin表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 張英，李冬梅，邢穎.姜黃素的藥理作用與載體研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2015，26（13）：1850-1853.

[ 2 ] REN Z，ZHANG R，LI Y，et al. Ferulic acid exerts neuroprotective effects against cerebral ischemia/reperfusion-induced injury via antioxidant and anti-apoptotic mechanisms in vitro and in vivo[J]. Int J Mol Med，2017，40（5）：1444-1456.

[ 3 ] XU Y，WANG L，HE J，et al. 2010 China noncommunicable disease surveillance group prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J]. JAMA，2013，310（9）：948- 959.

[ 4 ] MURTHY SB，JAWAID A，QURESHI SU，et al. Does diabetes mellitus alter the onset and clinical course of vascular dementia [J]. Behav Neurol，2010，23（3）：145-151.

[ 5 ] YOSHITAKE T，KIYOHARA Y，KATO I，et al. Incidence and risk factors of vascular dementia and Alzheimers disease in a defined elderly Japanese population：the hisayama study[J]. Neurology，1995.DOI：10.1212/wnl.45.6.1161.

[ 6 ] LEIBSON CL，ROCCA WA，HANSON VA，et al. Risk of dementia among persons with diabetes mellitus：a population-based cohort study[J]. Am J Epidemiol，1997.DOI：10.1093/oxfordjournals.aje.a009106.

[ 7 ] OTT A，STOLK RP，VAN HARSKAMP F，et al. Diabetes mellitus and the risk of dementia：the rotterdam study[J]. Neurology，1999.DOI：10.1212/wnl.53.9.1937.

[ 8 ] PEILA R，RODRIGUEZ BL，LAUNER LJ，et al. Type 2 diabetes，APOE gene，and the risk for dementia and related pathologies：the honolulu-asia aging study[J]. Diabetes，2002.DOI：10.2337/diabetes.51.4.1256.

[ 9 ] SZENDROEDI E，PHIELIX M，RODEN，et al. The role of mitochondria in insulin resistance and type 2 diabetes mellitus[J]. Nat Rev Endocrinol，2001，8（2）：92-103.

[10] GORDON SL，LEUBE RE，COUSIN MA，et al. Synaptophysin is required for synaptobrevin retrieval during synaptic vesicle endocytosis[J]. J Neurosci，2011，31（39）：14032-14036.

[11] TARSA L，GODA Y. Synaptophysin regulates activity-dependent synapse formation in cultured hippocampal neurons[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（2）：1012- 1016.

[12] TAMPELLINI D，CAPETILLO-ZARATE E，DUMONT M，et al. Effects of synaptic modulation on beta-amyloid，synaptophysin，and memory performance in Alzheimers disease transgenic mice[J]. J Neurosci，2010，30（43）：14299-14304.

[13] GRASSELLI G，HANSEL C. Cerebellar long-term potentiation：cellular mechanisms and role in learning[J]. Int Rev Neurobiol，2014. DOI：10.1016/b978-0-12-420247-4. 00003-8 .

[14] DUPUIS JP，BIOULAC BH，BAUFRETON J. Long-term depression at distinct glutamatergic synapses in the basal ganglia[J]. Rev Neurosci，2014，25（6）：741-754.

[15] ZHAO Y，LI Q，JIN A，et al. E3 ubiquitin ligase Siah-1 downregulates synaptophysin expression under high glucose and hypoxia [J]. Am J Transl Res，2015，7（1）：15-27.

（收稿日期：2018-05-23 修回日期：2018-10-17）

（編輯：鄒麗娟）