劉珊娜

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李斯特菌生長預(yù)測模型的研究進(jìn)展

劉珊娜1,2

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

單核細(xì)胞增生李斯特菌是一種重要的食源性致病菌，能夠污染多種類型的食品，危害食品安全。利用預(yù)測微生物學(xué)的研究方法建立微生物生長動力學(xué)模型，可對微生物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估和預(yù)測食品貨架期。本文介紹了單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長特點(diǎn)，簡述了預(yù)測食品微生物學(xué)的初級、二級和三級模型的分類，對于單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長動力學(xué)模型在培養(yǎng)基及不同類型食品中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)。

李斯特菌；生長模型；預(yù)測食品微生物學(xué)

李斯特菌屬廣泛分布于土壤、水、動植物和人體糞便中，包含單核細(xì)胞增生李斯特菌（單增李斯特菌，）、綿羊李斯特菌（）、英諾克李斯特菌（）、西爾李斯特菌（）、威爾李斯特菌（）、格氏李斯特菌（）等[1]。單增李斯特菌是目前國際公認(rèn)的重要食源性致病菌，也是我國國標(biāo)規(guī)定的必檢項(xiàng)目。單增李斯特菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性短桿菌，無芽孢，可運(yùn)動。該菌通過污染的食物進(jìn)入人體后誘發(fā)李斯特菌病，致死率高達(dá)25%～30%，主要針對免疫功能不全者、孕婦、新生兒和老年人[2]。由于該菌可在低溫環(huán)境中存活并繁殖，增加了即食食品（Ready-to-eat food）和冷藏食品的食用風(fēng)險(xiǎn)。多種類型的食品都有被該菌污染的報(bào)道，歐美國家也曾發(fā)生多起該菌引發(fā)的食品安全事件[3]。

預(yù)測食品微生物學(xué)（Predictive food microbiology）將微生物學(xué)、數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)與應(yīng)用計(jì)算機(jī)知識結(jié)合在一起，通過建立數(shù)學(xué)模型來預(yù)測微生物在不同環(huán)境條件下的生長、殘存和死亡等動態(tài)變化過程，為微生物風(fēng)險(xiǎn)評估和食品安全檢測提供理論依據(jù)。食源性病原菌或腐敗菌在食品加工、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)中的變化情況是預(yù)測微生物學(xué)的重要研究內(nèi)容。通過建立和應(yīng)用微生物生長規(guī)律模型，預(yù)測病原菌或腐敗菌實(shí)際生長或死亡情況，可提供即時(shí)參考數(shù)據(jù)，分析食品的安全性和貨架期。隨著預(yù)測食品微生物學(xué)的廣泛應(yīng)用，預(yù)測模型也逐漸擴(kuò)展到不同類型食品的研究中，指導(dǎo)改進(jìn)生產(chǎn)工藝和保證質(zhì)量安全。

1 單增李斯特菌的生長特點(diǎn)

單增李斯特菌最適生長溫度在37 ℃左右，培養(yǎng)8 h后進(jìn)入對數(shù)期，在14～18 h到達(dá)穩(wěn)定期[4]。該菌對溫度的抵抗力呈現(xiàn)出不對稱性，即在低溫條件下耐受性較強(qiáng)，在4 ℃的環(huán)境中也能生存,而對熱的抵抗力較弱。溫度會影響菌體生長的延滯期，溫度越低，延滯期越長。菌株生長pH值在5.0～9.6之間[5]，最適pH值為中性或弱堿性，這也是酸性抑菌的理論基礎(chǔ)。當(dāng)pH值為4.0時(shí)，不論溫度和鹽濃度如何變化，菌株的生長受到完全抑制[6]。單增李斯特菌能夠耐受較高的鹽濃度。周小紅等[4]測定該菌在NaCl濃度為0.5%～3.5%的范圍內(nèi)生長良好，當(dāng)NaCl濃度高于5.5%時(shí)菌株生長受到完全抑制。低劑量接種時(shí)（10和103CFU/mL），接種量低的菌液對環(huán)境的耐受性高于接種量高的菌液；隨著接種濃度的提高（103和105CFU/mL），菌株耐受性增強(qiáng)，具體機(jī)制尚未闡明[7]。綜合分析，單增李斯特菌的適應(yīng)能力強(qiáng)，易污染營養(yǎng)豐富的基質(zhì)，感染病例多由被污染的食品引起。

2 預(yù)測模型的分類和特點(diǎn)

動力學(xué)模型對微生物生長范圍和生長速率進(jìn)行模擬，分為生長（存活）模型和失活模型。預(yù)測模型可分為初級模型（Primary model）、二級模型（Secondary model）和三級模型（Tertiary model）。初級模型用來描述特定條件下微生物量隨時(shí)間變化的情況，常用的有Gompertz模型、Logistic模型、Richards模型、Baranyi & Roberts模型（Baranyi模型）和Huang模型等，可得到延滯期、最大比生長速率等參數(shù)；二級模型反映一級模型中各參數(shù)如微生物最大比生長速率與環(huán)境因子間的關(guān)系，包括響應(yīng)面方程（Response surface equation）、平方根方程（Square root model）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等；三級模型是在初級模型和二級模型的基礎(chǔ)上組建數(shù)據(jù)庫，用于直接預(yù)測的計(jì)算機(jī)軟件或程序如Pathogen Modeling Program（PMP）、Food spoilage predictor、Combined database （ComBase）和Seafood Spoilage and Safety Predictor（SSSP）。

2.1 Gompertz模型

Gompertz方程式為雙指數(shù)函數(shù)，表達(dá)式[8]為：

＝＋×exp{－exp[－（－）]}

是微生物在時(shí)間時(shí)常用對數(shù)值；是隨時(shí)間無限減小時(shí)漸進(jìn)對數(shù)值；是隨時(shí)間無限增大時(shí)菌增量的對數(shù)值；是時(shí)的相對最大生長速率；是達(dá)到相對最大生長速率所需時(shí)間。

Gompertz模型使用簡單，修正后的Gompertz模型為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，是描述微生物生長所常用的初級模型之一。有報(bào)道指出，其在擬合鮮切生菜中沙門氏菌生長曲線時(shí)的相關(guān)系數(shù)隨著儲藏溫度的下降而減小[9]?？赡茉谟诘蜏貤l件不在菌株最佳生長溫度范圍，曲線偏離“S”型而影響擬合效果。

2.2 Logistic模型

Logistic模型曲線具有斷點(diǎn)，適用于菌株生長延滯期預(yù)測，Tienungoon等[10]采用非線性Logistic模型計(jì)算單增李斯特菌在不同溫度、pH、鹽濃度等培養(yǎng)基中的生長極限。王旭等[11]應(yīng)用修正的Logistic方程擬合了37 ℃下單增李斯特菌在pH 5～9的培養(yǎng)基中的生長曲線，相關(guān)性大于0.99。該模型表達(dá)式[8]為：

＝/{1＋exp [4m（－）/＋2]}

是微生物在時(shí)相對菌數(shù)的常用對數(shù)值，即Logt0；是相對最大菌濃度，Logmax0；m是生長速率；是延滯期。

2.3 Baranyi模型

Baranyi模型是根據(jù)微生物的生長代謝機(jī)理推導(dǎo)動力學(xué)方程，既能用于描述致死曲線也適用于動態(tài)環(huán)境，對延滯期的估計(jì)和曲線擬合較準(zhǔn)確。馬晨等[12]利用Baranyi模型擬合沙門氏菌在鮮切黃瓜中的生長情況，并建立了具有可靠性的Ratkowsky二級模型來描述最大生長速率與儲藏溫度之間的關(guān)系，為評估該菌在鮮食蔬菜中的生長情況提供依據(jù)。Baranyi模型表達(dá)式[13]如下：

＝min＋（0－min）exp {－max[－（）]}

（）＝∫t0[r/r＋s]d

是時(shí)菌數(shù)；0是0時(shí)菌數(shù)；min是最小菌數(shù)；max是最大相對死亡率；、是參數(shù)。

2.4 Huang模型

Huang模型屬于三階段線型模型，反映了恒溫條件下微生物生長經(jīng)歷的延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期，有明顯的延滯期。表達(dá)式[14]如下：

＝0＋max－ln{exp（0）＋[exp（max）－exp（0）] exp [－×（）]}

0和max分別為的初始值和最大值；為生長速率，為延滯期。

2.5 二級模型和三級模型

二級模型中包括兩大類：一類是Ratkowsky的平方根模型和參數(shù)模型，另一類是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和響應(yīng)面模型。平方根模型建立了微生物生長速率與溫度平方根之間的線性關(guān)系，通過溫度變化考察微生物生長情況。其中Ratkowsky模型使用較多，能很好預(yù)測單一因素對最大比生長速率的影響，特別是溫度的影響。Arrhenius模型是在酶促反應(yīng)的基礎(chǔ)上推廣至多參數(shù)條件下微生物生長的描述。響應(yīng)面模型通過確定試驗(yàn)和回歸方程推導(dǎo)出未知參數(shù)值，提高擬合度和準(zhǔn)確性。

表1 二級模型的種類和表達(dá)式

目前已開發(fā)出多種預(yù)測模型軟件包括Growth Predictor、PMP、SSSP、Sym’ Previus、ComBase等，提供可靠性預(yù)測數(shù)據(jù)。這種基于三級模型的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)能夠比較不同環(huán)境因子對微生物生長的影響及相同環(huán)境因子對不同微生物生長的影響。雖然用于預(yù)測微生物生長的模型有多種，但目前并不能確定哪種模型具有明顯的優(yōu)越性，仍需通過實(shí)際培養(yǎng)微生物的數(shù)據(jù)來評價(jià)不同模型的擬合能力。

3 單增李斯特菌生長預(yù)測模型的應(yīng)用

3.1 在培養(yǎng)基中的應(yīng)用

目前，已建立單增李斯特菌在培養(yǎng)基中的預(yù)測模型，菌株隨溫度升高，生長速率變快；相同溫度下初始菌濃度越大，最大比生長速率越大。丁甜等[16]使用Gompertz模型建立了不同溫度下單增李斯特菌在營養(yǎng)肉湯中的生長模型，在此基礎(chǔ)上建立的二級模型中，Ratkowsky模型在精確性上優(yōu)于Linear和Square root模型，可更好預(yù)測不同溫度下菌株的最大比生長速率。此外，Logistic回歸模型用于單增李斯特菌生長/非生長條件的研究，反映了環(huán)境因子如溫度、pH、有機(jī)酸等的交互作用對菌株生長的影響[6]。研究結(jié)果為優(yōu)化生產(chǎn)工藝和提高產(chǎn)品的安全性提供了參考依據(jù)。

3.2 在肉制品中的應(yīng)用

與培養(yǎng)基相對穩(wěn)定的體系相比，食品原料對微生物的影響更為復(fù)雜。肉制品是極易發(fā)生腐敗變質(zhì)的食品類型，特別是在冷鮮肉中單增李斯特菌的污染在國內(nèi)外都有報(bào)道。由于Gompertz模型形式相對簡單，具有明確的生物學(xué)意義，已用于建立單增李斯特菌在肉制品中的生長預(yù)測模型[17]，通過測定初始菌數(shù)，判斷不同時(shí)間點(diǎn)的李斯特菌數(shù)。通過將Baranyi模型與改良Lotka-Volterra模型結(jié)合，建立了單增李斯特菌與假單胞菌的競爭生長模型[18]。

3.3 在蔬菜制品中的應(yīng)用

通過Gompertz、Logistic和Baranyi的初級模型，可建立在鮮食蔬菜、涼拌菜中單增李斯特菌的生長模型[5, 15]，并根據(jù)最大比生長速率建立二級模型，結(jié)合ComBase數(shù)據(jù)庫得到三級模型，用于描述李斯特菌菌株在不同溫度下的生長狀態(tài)，經(jīng)驗(yàn)證，較好預(yù)測了該菌在相應(yīng)環(huán)境中的生長情況。Fang等[19]利用Logistic模型結(jié)合不同二級模型預(yù)測了4～43 ℃溫度條件下單增李斯特菌在鮮切哈密 瓜上的生長情況。Danyluk等[20]通過Baranyi和Ratkowsky模型擬合了單增李斯特菌在鮮切哈密瓜、香瓜和西瓜中的生長情況，分析了溫度與菌株生長的關(guān)系，揭示了低溫環(huán)境下菌株生長量的持續(xù)增加。

3.4 在乳制品中的應(yīng)用

李斯特菌在乳制品中的檢出率較高，乳中豐富的營養(yǎng)給李斯特菌的生長提供了條件。特別是在低溫儲藏條件下，嗜冷菌成為原料乳中的優(yōu)勢微生物。例如美國近年就曾發(fā)生由巴氏殺菌乳、冰激凌和干酪污染引發(fā)的食品安全事件[21-22]。邱紅玲等[23]利用Gompertz模型建立了原料乳或復(fù)原乳中單增李斯特菌的生長模型，Tiwari等[24]也建立了單增李斯特菌在干酪中的初級生長預(yù)測模型，可用于保障乳制品的質(zhì)量安全。

3.5 影響模型準(zhǔn)確性的因素

對李斯特菌在不同環(huán)境條件下的初級生長模型研究已展開，但是預(yù)測效果受到多重因素的影響。特別是食品原料、加工工藝和儲藏環(huán)境的多樣性，給預(yù)測微生物帶來不確定性。在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)首先要從現(xiàn)實(shí)情況出發(fā)，盡量排除人為干擾。此外要綜合考慮整個(gè)食品加工過程，而不僅僅是某種特定條件，克服局限性。對于混合微生物的樣品，不應(yīng)忽視微生物之間的競爭或促進(jìn)關(guān)系。因此多因素條件下微生物預(yù)測模型的建立將是重要研究方向。此外，為提高預(yù)測準(zhǔn)確性，可采用多種模型擬合，不限定在單一模型。選擇合適的模型評價(jià)方法，通過偏差因子、準(zhǔn)確因子和均方根誤差等指標(biāo)進(jìn)行可靠性分析，最終篩選最優(yōu)模型。在軟件方面，主要應(yīng)用國外已有的預(yù)測模型和開放的數(shù)據(jù)庫資源[25]，還應(yīng)加強(qiáng)預(yù)測模型的開發(fā)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫的建立，以適應(yīng)多種環(huán)境因素。將多種生物學(xué)技術(shù)例如Real-time PCR、DNA雜交探針等應(yīng)用于預(yù)測微生物學(xué)，也為綜合評價(jià)模型的準(zhǔn)確性提供了更多途徑。

4 結(jié)論

李斯特菌在自然界廣泛存在，可造成多種食品的污染，給食品安全帶來潛在的危害。目前，李斯特菌病的中毒診斷方法尚未建立，仍需完善該病爆發(fā)和傳播的相關(guān)數(shù)據(jù)。隨著預(yù)測微生物學(xué)的發(fā)展，食源性致病菌在各種食品基質(zhì)中的生長動力學(xué)模型逐漸建立，但是對影響其準(zhǔn)確性的因素研究還不完善。只有不斷對數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，建立健全預(yù)測系統(tǒng)，才有利于評估李斯特菌在食品加工和儲運(yùn)體系中的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)和制訂有效的食品質(zhì)量安全控制方案。

[1] Kuenne C，Billion A，Mraheil M A，et al. Reassessment of thepan-genome reveals dynamic integration hotspots and mobile genetic elements as major components of the accessory genome[J]. BMC Genomics，2013，14（1）：47.

[2] Winkelstr?ter L K，De Martinis E C. Effect of bacteriocins and conditions that mimic food and digestive tract on biofilm formation，in vitro invasion of eukaryotic cells and internalin gene expression by[J]. Probiotics & Antimicrobial Proteins，2013，5（3）：153-164.

[3] Martinez-Rios V，Dalgaard P. Prevalence of，in European cheeses：A systematic review and meta-analysis[J]. Food Control，2018，84：205-214.

[4] 周小紅，李學(xué)英，楊憲時(shí)，等. 培養(yǎng)條件對單增李斯特菌生長的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2013，34（15）：140-143，148.

[5] 鄭麗敏. 即食涼拌菜中單增李斯特菌的風(fēng)險(xiǎn)評估與管理[D]. 上海：上海理工大學(xué)，2012.

[6] 周小紅，李學(xué)英，楊憲時(shí)，等. 環(huán)境因子及接種量對單增李斯特菌生長/非生長界面的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2015，36（7）：53-59.

[7] 周小紅，李學(xué)英，楊憲時(shí)，等. 接種量對單增李斯特菌生長期及生長界面的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（18）：180-184.

[8] 蒲月華. 納豆菌抗菌肽對對蝦中金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的控制效應(yīng)及數(shù)學(xué)模型建立[D]. 湛江：廣東海洋大學(xué)，2013.

[9] 朱奚慕. 鮮切生菜中沙門氏菌生長動力學(xué)預(yù)測模型的建立和驗(yàn)證[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[10] Tienungoon S，Ratkowsky D A，Mcmeekin T A，et al. Growth limits ofas a function of temperature，pH，NaCl，and lactic acid[J]. Applied & Environmental Microbiology，2000，66（11）：4979-4987.

[11] 王旭，孫曉紅，潘迎捷，等. 單增李斯特菌及其缺失突變株在不同pH下生長動力學(xué)的比較[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2016，35（5）：477-484.

[12] 馬晨，李建國，程景. 沙門氏菌在鮮切蔬菜中生長行為及其預(yù)測模型構(gòu)建[J]. 食品工業(yè)科技，2016，37（4）：123-127.

[13] 周康，劉壽春，李平蘭，等. 食品微生物生長預(yù)測模型研究新進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（4）：589-594.

[14] 牛會敏，李苗云，趙改名，等. 低溫條件下冷卻豬肉中假單胞菌生長模型的比較分析[J]. 食品科學(xué)，2013，34（5）：142-146.

[15] 張引成. 單增李斯特菌在鮮切結(jié)球萵苣中生長和抑菌預(yù)測模型的建立[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[16] 丁甜，董慶利，王璐，等. 單增李斯特菌在營養(yǎng)肉湯中最大比生長速率的預(yù)測模型[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（4）：522-526.

[17] 高繼銘. 醬鹵肉中代表性致病菌預(yù)測微生物學(xué)研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[18] 陳爾凝，白羽，馬凱，等. 豬肉中單增李斯特菌與假單胞菌的競爭生長預(yù)測模型建立[J]. 食品科學(xué)，2013，34（23）：256-260.

[19] Fang T，Liu Y，Huang L. Growth kinetics ofand spoilage microorganisms in fresh - cut cantaloupe[J]. Food Microbiology，2013，34（1）：174-181.

[20] Danyluk M D，F(xiàn)riedrich L M，Schaffner D W. Modeling the growth ofon cut cantaloupe，honeydew and watermelon[J]. Food Microbiology，2014，38（4）：52-55.

[21] Cumming M，Kludt P，Matyas B，et al. Outbreak ofinfections associated with pasteurized milk from a local dairy-Massachusetts，2007[J]. Journal of the American Medical Association，2009，301（8）：1097-1100.

[22] 張亞紅，王娉，楊海榮，等. 預(yù)測微生物學(xué)在乳及乳制品中的應(yīng)用[J]. 檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2015，25（6）：62-65.

[23] 邱紅玲，唐曉陽，王李偉，等. 復(fù)原乳中三種常見致病菌的生長動力學(xué)模型構(gòu)建[J]. 上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，28（5）：288-293.

[24] Tiwari U，Walsh D，Rivas L，et al . Modelling the interaction of storage temperature，pH，and water activity on the growth behaviour ofin raw and pasteurised semi-soft rind washed milk cheese during storage following ripening[J]. Food Control，2014，42（3）：248-256.

[25] 劉靜，杜廣全，管驍. 食品預(yù)測微生物軟件的分析與比較[J]. 食品與機(jī)械，2016，32（4）：61-66，70.

責(zé)任編輯：張愛婷

Research progress in predictive models forgrowth

LIU Shan-na1,2

（1. College of Food Science and Bioengineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, Tianjin 300384, China）

is an important food-borne pathogen which may contaminate many types of food and impair food safety. Research methods of predictive food microbiology can be used for building growth kinetic models, which may assess microbial risk and predict food shelf life. This article introduced growth characteristics of. The classification of primary, secondary and tertiary models of predictive food microbiology were briefly reviewed. Applications ofgrowth kinetic models in culture medium and different foods were summarized.

; growth model; predictive food microbiology

1008-5394（2018）03-0092-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.020

Q939.99

A

2018-02-26

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31501583）

劉珊娜（1984-），女，講師，博士，主要從事食品微生物研究。E-mail：lsn_nxy@aliyun.com。