王 英 ，孫宇鵬 ，張 偉

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟(jì)南 250011）

間質(zhì)性肺?。↖LD），又稱彌漫性實(shí)質(zhì)性肺?。―PLD），是一組以肺泡壁炎細(xì)胞浸潤和纖維化改變?yōu)榛静±肀憩F(xiàn)的肺部疾病的總稱。其中特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（IPF）是一種病因仍不明確，并且病情進(jìn)行性加重，主要病理表現(xiàn)為纖維化伴蜂窩狀改變，占特發(fā)性間質(zhì)性肺炎（IIP）的 60%-70%[1]，IPF 治療指南中強(qiáng)不推薦糖皮質(zhì)激素等治療，尼達(dá)尼布和吡非尼酮被推薦用于IPF的治療[2]，其發(fā)病率逐年增加，5 a生存率低導(dǎo)致、治療藥物局限導(dǎo)致IPF成為臨床治療難題。針對以上臨床治療間質(zhì)性肺病的現(xiàn)狀及觀察近年來中醫(yī)中藥治療本病的進(jìn)展，結(jié)合活血化瘀類中藥治療間質(zhì)性肺病的臨床研究，選取紅花單味藥治療間質(zhì)性肺病，并進(jìn)行對比研究，通過氣管內(nèi)博萊霉素（BLM）建立間質(zhì)性肺病小鼠模型，分析中藥紅花的提取物紅花黃色素對間質(zhì)性肺病的作用機(jī)制，力爭進(jìn)一步研究活血化瘀類藥物紅花在治療間質(zhì)性肺中的作用機(jī)制，為中藥治療本病提供新的思路。

1 材料

注射用紅花黃色素注射液（購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）；BLM（購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，貨號：LB3051）；低分子量肝素鈉注射液，購自齊魯制藥有限公司，貨號：H20030429；TRNzol總RNA提取試劑，購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP405-02；ROX plus，購自 TaKaRa，貨號：RR82LR；小鼠白介素（IL）-6酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，產(chǎn)品編號：EK0411。TGF-β1 ELISA檢測試劑盒，購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，貨號：KGEHC107b-1；CTGFELISA 檢測試劑盒，購自上海超研生物科技有限公司，貨號：SEA010HU。

2 方法

2.1 動(dòng)物 KM小鼠90只（山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SYXK（魯）201400007號），鼠齡為8周齡，體質(zhì)量為18～22 g。隨機(jī)分為對照組、模型組及紅花黃色素組3組，每組為30只。模型組和紅花黃色素組予BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化，建立雄性間質(zhì)性肺病小鼠模型，對照組以生理鹽水代替；實(shí)驗(yàn)開始后第21天，隨機(jī)取3只小鼠解剖，第28天解剖全部小鼠，取肺組織，結(jié)束實(shí)驗(yàn)，其中第21天、第28天取右下肺分別做病理切片；第28天取左下肺葉用ELISA法測定TGF-β1、IL-6；第28天取右中上肺葉應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR（RTPCR）法檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和內(nèi)皮細(xì)胞型纖溶酶原激活物抑制因子（PAI-1）的表達(dá)。

2.2 組織處理 處死小鼠后取出肺組織于10%中性甲醛中固定，經(jīng)脫水、包埋制成蠟塊并制作病理切片，Masson染色觀察。

2.3 ELISA法檢測各組小鼠肺組織中TGF-β1、IL-6含量 取小鼠完整左下肺臟，用預(yù)冷的生理鹽水清肺臟，無菌紗布擦拭，稱質(zhì)量，在冰盤上剪碎，按照每克肺組織加10 mL生理鹽水，在冰浴條件下用組織勻漿機(jī)以15 000 r/min的轉(zhuǎn)速研磨，制成肺勻漿，離心后取上層清液，采用ELISA法測定IL-6以及TGF-β1的含量。

2.4 Real Time PCR方法檢測VEGF和PAI-1 mRNA的表達(dá) 取小鼠完整右上、中肺葉，用生理鹽水沖去肺臟表面的組織和血污，儲存于-80℃冷凍柜中，提取RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用RT-PCR方法檢測VEGF和PAI-1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

表1 引物序列及PCR產(chǎn)物大小

2.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3法。P＜0.05說明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變 空白組肺內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰正常，未見炎性浸潤，無充血以及纖維組織增生，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出。模型組肺泡結(jié)構(gòu)破壞、融合嚴(yán)重，肺泡腔內(nèi)存在大量炎性浸潤，纖維組織增生明顯，后期較前期損壞明顯。紅花黃色素組間質(zhì)毛細(xì)血管充血、水腫，存在炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡肺泡融合、閉陷，纖維組織輕度增生。

圖1 光鏡下經(jīng)Masson染色肺組織病理表現(xiàn)

3.2 ELISA法檢測各組小鼠肺組織中TGF-β1、IL-6含量 與空白組比較，模型組小鼠肺組織TGF-β1、IL-6含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，注射用紅花黃色素組小鼠肺組織TGF-β1含量明顯降低（P＜0.01），IL-6 含量降低（P＜0.05），見表 2。

表2 各組小鼠肺組織中TGF-β1、IL-6表達(dá)含量（s，n=30）pg/mL

表2 各組小鼠肺組織中TGF-β1、IL-6表達(dá)含量（s，n=30）pg/mL

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n TGF-β1 IL-6的濃度模型組 30 125.79±20.98** 74.61±11.96**紅花黃色素組 30 91.13±21.28## 64.41±10.03#對照組 30 73.27±22.02 49.97±10.76

3.3 RT-PCR法檢測各組小鼠肺組織中PAI-1、VEGFmRNA的表達(dá)水平 與空白組比較，模型組小鼠肺組織PAI-1、VEGF mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，注射用紅花黃色素組小鼠肺組織VEGF表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），PAI-1表達(dá)水平無差異，見表3。

表3 各組小鼠肺組織中PAI-1、VEGF mRNA的表達(dá)水平（±s，n=30）注：與對照組比較：*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

4 討論

近些年來臨床觀察及研究表明中醫(yī)藥治療本病存在優(yōu)勢，獲效顯著，但治療機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究仍不全面?；钛鏊?，性味以辛、苦、溫為主，辛能散、行，苦則通泄，且入血分，所以活血化瘀藥可行血活血，通暢脈絡(luò)，消瘀散滯。紅花是一味傳統(tǒng)的活血祛瘀中藥，本文通過實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)用中藥紅花的提取物紅花黃色素治療博萊霉素所致間質(zhì)性肺病小鼠，從相關(guān)基因表達(dá)及細(xì)胞因子等角度進(jìn)行分析，檢測 TGF-β1、IL-6、PAI-1、VEGF 等各項(xiàng)指標(biāo)[3-6]。

本實(shí)驗(yàn)研究中，與空白組比較，模型組小鼠肺組織 TGF-β1、IL-6、PAI-1、VEGF mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，紅花黃色素組小鼠肺組織 TGF-β1含量明顯降低（P＜0.01），IL-6含量降低（P＜0.05），紅花黃色素組小鼠肺組織VEGF表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），PAI-1表達(dá)水平無差異，紅花黃色素治療組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)總體優(yōu)于模型組小鼠，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示中藥紅花的提取物紅花黃色素可以在治療間質(zhì)性肺病中通過多途徑延緩病情發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究紅花治療間質(zhì)性肺病提供理論基礎(chǔ)。