泡菜中高效氨氮降解菌的篩選及鑒定

馮愛娟，朱美娟，陳美娟，蘇莉莎，葉茂*

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣州 510300；2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣州 510300)

近年來，由于工業(yè)的快速發(fā)展，排出的廢水急劇增加，導(dǎo)致水污染的原因有很多，如有機(jī)污染物、無機(jī)污染物等，其中廢水中氨氮含量嚴(yán)重超標(biāo)導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，危害環(huán)境。氨氮是水相環(huán)境中氨的主要形態(tài)，是造成水體富營養(yǎng)化的主要污染物。因此，氨氮的含量可以作為污水水質(zhì)的重要指標(biāo)。水體污染給環(huán)境和人類的生活造成了威脅[1,2]。根據(jù)搜查的相關(guān)資料，氨氮含量的排放量劇增，造成氮循環(huán)不規(guī)律[3]，為保證水資源的可持續(xù)發(fā)展，開發(fā)出更高效的氨氮處理技術(shù)成為目前迫在眉睫的事情?，F(xiàn)今，國內(nèi)外對高氨氮廢水處理方面也展開了較多研究，除了傳統(tǒng)的方法外，還有現(xiàn)推行的方法生物脫氮技術(shù)[4]，生物脫氮是利用從自然界中獲得的有益微生物降解氨氮，生物脫氮技術(shù)具有無污染、經(jīng)濟(jì)和安全等優(yōu)點(diǎn)，因此更加備受關(guān)注。生物脫氮技術(shù)的核心是篩選能高效降解氨氮的微生物，所以前人對這方面進(jìn)行了大量的研究工作。近十幾年來，很多學(xué)術(shù)上的學(xué)者從研究河蝦等水殖產(chǎn)業(yè)的污水、某工業(yè)地的淤泥中篩選出能降解廢水中氨氮的菌株，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道過的有硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌、高效脫氮除磷菌等降解氨氮的菌株[5]，在這方面也有了一定的進(jìn)展。眾多研究結(jié)果表明，高氨氮污水及污泥中篩選高效菌株是最為有效的優(yōu)良菌劑獲取方法，但盡管目前投入了大量的嘗試性研究，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到有效、節(jié)約地處理污水氨氮的程度。因此，應(yīng)對目前全國范圍內(nèi)各種污染類型水體中普遍發(fā)生的氨氮超標(biāo)問題，篩選出高效菌株并對其性能進(jìn)行優(yōu)化仍是當(dāng)前及未來的主要研究方向。我們也向著這個(gè)方向出發(fā)，研究以市售泡菜為原材料，使用富集與分離的方法篩選氨氮降解菌，通過測定其氨氮降解率以獲得1株高效的氨氮降解菌株，并對其降解條件進(jìn)行優(yōu)化，期望能為我國處理水體的氨氮提供一條新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 泡菜樣品

泡菜樣品：市售。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 富集培養(yǎng)基

葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO42.5 g，NaCl 2.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO41.0 g，pH值7.2～7.4，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1000 mL。取200 mL富集培養(yǎng)基放入1000 mL錐形瓶中，115 ℃滅菌30 min。

1.2.2 分離平板培養(yǎng)基

葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO42.5 g，NaCl 2.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO41.0 g，pH值7.2～7.4，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，水1000 mL，115 ℃滅菌30 min。

1.2.3 活化培養(yǎng)基

蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，K2HPO42 g，NaCl 5 g，水1000 mL，pH值7.0～7.2，過濾分裝后于115 ℃滅菌30 min。

1.2.4 斜面培養(yǎng)基

采用Luria-Bertani (LB)瓊脂培養(yǎng)基，其組成如下：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L和瓊脂20 g/L。將pH調(diào)至7.5，121 ℃滅菌20 min。

1.2.5 搖瓶種子培養(yǎng)基

采用LB液體培養(yǎng)基，將pH調(diào)至7.5，121 ℃滅菌20 min。

1.2.6 篩選培養(yǎng)基

葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO42.5 g，NaCl 1.0 g，K2HPO40.5 g，pH值7.2～7.4，MgSO4·7H2O 0.25 g，去離子水定容至1000 mL，此時(shí)NH4-N含量為500 mg/L，分裝于1000 mL三角瓶中，每瓶200 mL，115 ℃滅菌30 min。

1.3 分離篩選出氨氮降解菌

1.3.1 氨氮降解菌的富集

配制好190 mL富集培養(yǎng)基，滅菌、冷卻后，從混合均勻的泡菜樣品中取出30 g，接入裝有富集培養(yǎng)基的1000 mL三角瓶中，搖勻，再放入150 r/min，28 ℃的恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后測定pH值；然后取出10 mL上清菌液，加到新鮮富集培養(yǎng)基中在相同條件下再次富集培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后再測定pH值，觀察從培養(yǎng)基到富集2次后的pH值的變化情況。

1.3.2 氨氮降解菌的分離純化

配制好分離平板培養(yǎng)基，滅菌、分裝、冷卻后，取第2次富集培養(yǎng)基中的上清菌液1 mL，在無菌操作條件下將培養(yǎng)液稀釋、涂布于分離平板培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3天，至平板長出單菌落為止；挑取各個(gè)單菌落至新的平板上劃線，28 ℃下培養(yǎng)2～3天，至平板上長出單菌落為止，以進(jìn)一步純化；挑選各個(gè)單菌落于斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃下培養(yǎng)24 h；待斜面長出菌苔后，分別以斜面固態(tài)保藏于4 ℃冰箱和中制成甘油管保藏于-20 ℃冰箱中。

1.3.3 制備菌懸液及測定細(xì)胞濃度

將活化后的各菌種接入搖瓶種子培養(yǎng)基；各接入1環(huán)，于150 r/min、28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h；在4 ℃、10000 r/min下離心15 min并棄上清液，收集菌體；將濕菌體加至無菌的生理鹽水中洗滌3～4次[6]，測定OD600=1，并將其配制成細(xì)胞濃度約為109個(gè)/mL的菌懸液備用。

1.3.4 篩選高效降解菌

制備搖瓶篩選培養(yǎng)基190 mL加入1000 mL的三角瓶中，滅菌、冷卻后，分別接入各菌株的細(xì)胞濃度相等的菌懸液；置于150 r/min、28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h；采用《水楊酸分光光度法》分析經(jīng)各菌種降解后的培養(yǎng)基中的氨氮?dú)埩袅?24，48，72 h各測1次)；用未接種的搖瓶做參照，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算氨氮降解率。參照文獻(xiàn)[7]中提出的方法，并按式(1)計(jì)算菌株的氨氮降解率：

(1)

綜合數(shù)據(jù)，根據(jù)降解率的大小，優(yōu)選出降解效率最高的目的菌株。

1.3.5 高效降解菌菌株最大吸收波長的測定

配制好100 mL活化培養(yǎng)基，滅菌、冷卻后，將優(yōu)選出的菌株在活化培養(yǎng)基中活化24 h(將斜面保藏的菌種接1環(huán)到活化培養(yǎng)基中，置于28 ℃和150 r/min條件下培養(yǎng)24 h)，取培養(yǎng)液用紫外-可見光分光光度儀在340～600 nm的波長下以未接種的培養(yǎng)基為參比測定其OD值，以波長為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)畫圖，確定該優(yōu)選菌株的最大吸收波長。

1.3.6 高效降解菌菌株的生長曲線測定

將活化好的優(yōu)選菌株，接1環(huán)至新鮮的活化培養(yǎng)基，在28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，在該優(yōu)選菌株的最大吸收波長處，每隔2 h取一定量培養(yǎng)液測定其OD值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以最大吸收波長處的OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.7 氨氮降解菌菌株的初步鑒定

對優(yōu)選菌種進(jìn)行平板培養(yǎng)、革蘭氏染色，觀察其菌落形態(tài)及革蘭氏屬性。同時(shí)，參照文獻(xiàn)[8-10]，如《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》的方法，對生理生化特征等方面進(jìn)行初步鑒定，如葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、需氧性試驗(yàn)等。

1.3.8 菌株的16S rDNA測序

氨氮降解菌菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增引物采用通用引物：正向引物27F為5′-AGAGTTTGATCC-

TGGCTCA-3′，反向引物1492R為5′-GGTTACCTTG-

TTACGACTT-3′(由上海生物工程有限公司合成)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測后送上海生物工程有限公司測序，將測得序列通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行BLAST比對，找出核酸數(shù)據(jù)庫中與氨氮降解菌菌株同源性較高的菌株序列，下載這些菌株的DNA序列，然后用生物軟件MEGA4進(jìn)行CLUSTAL比對并構(gòu)建氨氮降解菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 分離篩選高效氨氮降解菌的結(jié)果

富集實(shí)驗(yàn)的情況如下：第1天富集后pH為6.10；第2天為4.5，說明富集的菌株是產(chǎn)酸的；分離純化試驗(yàn)：從泡菜原材料中共篩選了25株能降解高濃度氨氮的菌株；最后對這25株菌進(jìn)行了氨氮降解率的測定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：在氨氮濃度為500 mg/L的液體培養(yǎng)基下，24 h內(nèi)這些菌株氨氮降解率的范圍為3.85%～29.81%；48 h的氨氮降解率范圍為13.46%～43.64%，72 h的氨氮降解范圍為35.72%～64.85%。由于硫酸銨在培養(yǎng)基滅菌過程中會出現(xiàn)高溫分解，從而導(dǎo)致NH4-N的濃度降低，因此在培養(yǎng)基的配制過程中采用先不加硫酸銨滅菌后，通過過濾除菌將硫酸銨加入到培養(yǎng)基中后接種培養(yǎng)。試驗(yàn)表明：LJK8菌株的降解率最高為 64.85%，因此對LJK8菌株做進(jìn)一步的研究。

2.2 LJK8菌株最大吸收波長的測定

LJK8菌株吸收波長實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 LJK8菌株吸收波長Fig.1 The maximum absorbing wavelength of LJK8 strain

由圖1可知，在波長340～600 nm之間，LJK8菌株在380 nm處有最大吸收峰，由此在380 nm處測其生長曲線，以研究其生長量與氨氮降解率之間的關(guān)系。

2.3 LJK8菌株的生長曲線測定

LJK8菌株的生長曲線測定結(jié)果見圖2。

圖2 LJK8菌株的生長曲線Fig.2 The growth curve of LJK8 strain

由圖2可知，LJK8菌株在0～6 h為生長的適應(yīng)期；在6～14 h為對數(shù)生長期；在14～36 h為生長的穩(wěn)定期；在36 h之后才有所衰亡。LJK8菌株達(dá)到最大生長量是在培養(yǎng)第20 h。

2.4 LJK8菌株的初步鑒定

觀察LJK8菌株的平板培養(yǎng)情況，(見圖3)，菌落為乳白色但不透明，圓形，邊緣整齊。菌株經(jīng)革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察(見圖4)，細(xì)胞完全是細(xì)桿狀，均為紫色，因此屬于革蘭氏陽性菌且無芽孢。

圖3 LJK8菌株的菌落形態(tài)Fig.3 Colony of LJK8 strain

圖4 LJK8菌株的革蘭氏染色圖Fig.4 Gram staining of LJK8 strain

2.5 LJK8菌株的生理生化試驗(yàn)

經(jīng)過一系列的生理生化試驗(yàn)，觀察結(jié)果，見表1。

表1 生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of physiological and biochemical test

2.6 LJK8菌株的16S rDNA測定結(jié)果

將LJK8菌株的16S rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫并構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖5?？梢猿醪借b定LJK8菌株屬于Rheinheimeraaquatica(水萊茵海默氏菌)，擴(kuò)增的16S rDNA與Rheinheimeraaquatica序列相似性達(dá)到99.99%，序列同源性為98%，所以初步確定該菌株為Rheinheimeraaquatica。

LJK8菌株的16S rDNA序列：

CGTAGGAAGCTACCCGATAGAGGGGGATACCAGTTGGAAACGACTGTTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGTGTGGGACCTTCGGGCCACATGCTATCGGATGCGCCTACGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTTGGGAGGAAGGGTTGTGTGTTAATAGTACACAGCCTTGACGTTACCAACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGAAGCGCACGTAGGCGGTTTTTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGAAACTGGAAAACTAGAGTGTGTGAGAGGGGGGTAGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGCACAACACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGCTGTTCGTGACCTTGTGTCGTGAGTAGCGCAGCTAACGCACTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAAGACTGCAGAGATGCGGTTGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTATGTACAGAGGGAGGCAAGCTGGCGACAGTGAGCGGATCTCTTAAAGCATATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAAATCAGAATGTTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAA。

圖5 LJK8的16S rDNA序列比對結(jié)果Fig.5 16S rDNA sequence comparison results of LJK8 strain

3 討論

從鹽含量高的泡菜為原料，以硫酸銨為唯一氮源的篩選培養(yǎng)基，篩選出具有氨氮降解能力的微生物，再進(jìn)行分離和純化，篩選出1株對高氨氮含量水相具有較高降解效率的菌株LJK8。經(jīng)過測定，LJK8的最大波長及生長曲線、革蘭氏染色及對其進(jìn)行的一系列生理生化試驗(yàn)，可以初步了解LJK8菌株的基本屬性。LJK8菌株的最適吸收波長在380 nm處，由其生長曲線可以看出，LJK8菌株在培養(yǎng)14 h時(shí)達(dá)到最大生長量；當(dāng)以氨氮初始含量為500 mg/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，并測定其氨氮降解率，在24～72 h內(nèi)的降解效率達(dá)到64.85%，通過對LJK8菌株生長量及氨氮含量變化的檢測，表明菌株生長與降解氨氮是同步進(jìn)行的，說明其可在較長時(shí)間內(nèi)發(fā)揮降解作用。

目前對能處理水體或者土壤中氨氮的文獻(xiàn)報(bào)道還比較少，而我們研究從泡菜中篩選出來的高效氨氮降解菌LJK8菌株屬于Rheinheimeraaquatica(水萊茵海默氏菌)，還未見該菌用于氨氮降解的報(bào)道，LJK8如果應(yīng)用于水體污染的處理方面還有很大的發(fā)展?jié)摿?，因此可對其在養(yǎng)殖污水、工業(yè)污水或者土壤中氨氮的深度凈化處理上的應(yīng)用再進(jìn)一步進(jìn)行研究。不過篩選出來的LJK8菌株相對于同一時(shí)段篩選的其他菌株的氨氮降解效率雖然較高，但是在如此高濃度的氨氮條件下仍然還有相當(dāng)量的氨氮?dú)埩簦虼宋覀兒笃趯芯吭摼慕到夤に?，并對其降解條件進(jìn)行優(yōu)化，增強(qiáng)菌株對高濃度氨氮污水的凈化能力。期望LJK8能在后期的養(yǎng)殖污水及水體污染處理方面發(fā)揮一定的作用。