莫緒成，曾亞琦,2，王建文,2，孟軍,2，姚新奎,2，賽亞熱·艾尼玩爾，梅香

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)馬產(chǎn)業(yè)研究院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】大蒜素作為綠色飼料添加劑，在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用較多。不同動(dòng)物的機(jī)體生理活動(dòng)不完全相同，故大蒜素對(duì)其作用效果、影響機(jī)理也存在一定區(qū)別，補(bǔ)飼適量的大蒜素可以作用于家禽的免疫系統(tǒng)從而影響機(jī)體的免疫球蛋白分泌，另一方面，大蒜素也可以作用于運(yùn)動(dòng)屬性動(dòng)物機(jī)體的乏氧誘導(dǎo)因子生成，從而減少缺氧狀態(tài)下組織細(xì)跑的損害。因此，通過試驗(yàn)逐步認(rèn)識(shí)大蒜素在運(yùn)動(dòng)馬日糧中的添加效果，深入探討其作用機(jī)理，并選擇出適宜的補(bǔ)飼劑量，對(duì)于運(yùn)動(dòng)馬的健康具有重要的理論價(jià)值與實(shí)踐意義，也可以為運(yùn)動(dòng)馬飼料添加劑的研發(fā)做參考依據(jù)，為運(yùn)動(dòng)馬的科學(xué)飼養(yǎng)管理提供理論參考。【前人研究進(jìn)展】現(xiàn)有研究普遍認(rèn)為大蒜素是一種天然植物性廣譜抗生素，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、清除自由基等功能，在各種動(dòng)物飼料中添加大蒜素，能夠提高動(dòng)物的成活率，減少患病率[1,2]。張小永等[3]研究認(rèn)為補(bǔ)飼大蒜素能夠?qū)崿F(xiàn)增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體非特異性免疫功能的效果。大蒜素可通過影響機(jī)體運(yùn)動(dòng)的自由基代謝、心肌與骨骼肌的微損傷程度、炎癥反應(yīng)和心血管調(diào)節(jié)能力等方面，來緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞[4,5]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國內(nèi)對(duì)于大蒜素的應(yīng)用研究主要集中在提高動(dòng)物免疫力方面，而針對(duì)大蒜素的抗疲勞作用也有一些初步的研究[6]。目前，將大蒜素的免疫作用和抗疲勞作用運(yùn)用在同一試驗(yàn)對(duì)象上的研究較少，試驗(yàn)通過研究補(bǔ)飼不同劑量大蒜素對(duì)伊犁馬運(yùn)動(dòng)后血液指標(biāo)的變化規(guī)律，研究大蒜素對(duì)運(yùn)動(dòng)型馬匹的抗疲勞和增強(qiáng)免疫能力的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)四組伊犁馬測(cè)試賽后即刻血液進(jìn)行檢測(cè)，分析不同劑量組馬匹運(yùn)動(dòng)后血液指標(biāo)的變化規(guī)律以及大蒜素抗疲勞和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用效果，量化大蒜素補(bǔ)飼劑量，為伊犁馬的日常生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持，為馬匹健康養(yǎng)殖提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)地點(diǎn)位于新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣西域賽馬場(chǎng)。

選取16匹3～4歲健康伊犁馬母馬為試驗(yàn)動(dòng)物，體尺、體重相近，試驗(yàn)前馬匹均進(jìn)行較為系統(tǒng)地調(diào)教訓(xùn)練，試驗(yàn)過程中所有馬匹進(jìn)行集中飼養(yǎng)管理。試驗(yàn)馬匹均由新疆昭蘇縣西域馬業(yè)有限責(zé)任公司提供。

試驗(yàn)馬匹采用單廄飼養(yǎng)管理模式，粗飼料(干牧草)每匹馬每天的飼喂量要保證充足(自由采食)，自由飲水。飼喂粗飼料時(shí)間為每天早上08:00，13:30，18:00 和23:00。馬廄按規(guī)定時(shí)間打掃，糞便和墊料要及時(shí)清除，按時(shí)為圈舍換干燥柔軟的墊草，保持圈舍舒適條件，確保馬匹長期處于舒適狀態(tài)。

1.1.2 試驗(yàn)器材

德國產(chǎn)H/P/cosmos便攜式血乳酸分析儀(含試片)、真空采血管(含采血針)、離心機(jī)、保溫箱、移液槍(含槍頭)、日立 7600系列自動(dòng)生化分析儀、MAGLUMI 4000 Plus全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀等。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將所選馬匹隨機(jī)分為4組(對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組)，每組4匹。每匹馬每天補(bǔ)飼4 kg精料(分兩次飼喂，每次2 kg)，每次補(bǔ)精料的時(shí)間為08:20，18:20。對(duì)照組精料中不添加大蒜素，試驗(yàn)I組、II組和III組精料中分別添加大蒜素100、300和500 mg/kg[7]。在補(bǔ)喂精料時(shí)，將預(yù)先稱量封裝好的大蒜素分別按劑量拌入其中，采食結(jié)束后，將馬匹牽入活動(dòng)場(chǎng)，讓其自由活動(dòng)，隨后統(tǒng)一安排訓(xùn)練。對(duì)所選馬匹進(jìn)行為期30 d試驗(yàn)，其中在第0 d、第10 d、第20 d和第30 d進(jìn)行1 000 m速度測(cè)試賽，并于測(cè)試賽結(jié)束后即刻采集靜脈血樣本2管。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)

將其中一管血液樣本通過H/P/cosmos便攜式血乳酸分析儀測(cè)定血液樣本中血乳酸(LAC)含量。另一管血液樣本靜置后，使用離心機(jī)進(jìn)行3 500 r/min 離心15 min分離血清，分離后將血清置于-20℃保存待測(cè)。采用日立全自動(dòng)生化儀(7600)測(cè)定鈣離子(Ca2+)與鉀離子(K+)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)與谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、乳酸(LAC)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、補(bǔ)體C3(C3) 補(bǔ)體C4(C4)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，運(yùn)用SPSS 21.0軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼喂時(shí)間對(duì)疲勞和免疫的影響

研究表明，K+濃度在飼喂第20 d時(shí)顯著低于第0 d(P<0.05)，與第30 d時(shí)差異不顯著(P>0.05)；第0 d、第10 d和第30 d兩兩間差異均不顯著(P>0.05)。Ca2+濃度在飼喂第30 d時(shí)顯著低于第0 d、第10 d和第20 d(P<0.05)，但第0 d、第10 d和第20 d兩兩間差異均不顯著(P>0.05)。AST活性和ALT活性在飼喂第30 d時(shí)顯著高于第0 d(P<0.05)，與第10 d和第20 d之間差異均不顯著(P>0.05)，第10 d和第20 d時(shí)均與第0 d差異不顯著(P>0.05)。CK活性在飼喂第30 d時(shí)極顯著高于第0 d、第10 d和第20 d(P<0.01)，第0 d、第10 d和第20 d兩兩間差異均不顯著(P>0.05)。CK-MB活性在第30 d時(shí)極顯著高于第10 d(P<0.01)，顯著高于第0 d(P<0.05)；第10 d時(shí)和第0 d時(shí)差異不顯著(P>0.05)，第20 d時(shí)與其余各組間差異均不顯著(P>0.05)。LDH活性在第30 d時(shí)極顯著高于第10 d(P<0.01)；第10 d時(shí)顯著低于第0 d時(shí)(P<0.05)；第20 d時(shí)與其余各組間差異均不顯著(P>0.05)。LAC濃度在飼喂第10 d時(shí)顯著低于第0 d時(shí)(P<0.05)，第20 d和第30 d均與第0 d之間差異不顯著(P>0.05)。表1

表1 血漿中電解質(zhì)及生化指標(biāo)隨時(shí)間變化
Table 1 Changes of electrolytes and biochemical parameters in plasma over time

0(d)10(d)20(d)30(d)K+ (mmol/L)6.11±1.14a6.31±2.54a4.51±0.89b5.24±1.79abCa2+ (mmol/L)3.12±0.11a3.13±0.14a3.14±0.20a2.99±0.11bAST (IU/L)442.07±94.16b493.45±169.54ab508.91±175.91ab671.33±346.80aALT (IU/L)17.67±4.45b18.64±5.20ab17.82±6.01ab24.92±14.13aCK (U/L)321.20±110.14B301.91±116.18B378.64±153.23B604.67±317.14ACK-MB (U/L)340.93±77.76ABb294.73±73.12Bb352±62.57ABab408.08±86.54AaLDH ( U/L)488.27±102.78ABa416.36±65.98Bb442.91±64.02ABab505.75±72.70AaLAC (mmol/L)19.89±1.89a16.72±5.52b19.11±1.98ab18.55±2.55ab

注：同行不同大寫字母表示極顯著差異，P<0.01；同行不同小寫字母表示顯著差異，P<0.05。下同

Note:Different capital letters in one row extremely significant differences (P<0.01),different lowercase letters show significant differences (P<0.05). The same as below

根據(jù)不同飼喂時(shí)間分組，免疫指標(biāo)分析結(jié)果表明，IgM、IgG、C3和C4在補(bǔ)飼不同階段差異性不顯著(P>0.05)。表2

表2 血漿中免疫指標(biāo)隨時(shí)間變化
Table 2 Changes of immune index in plasma over time

0(d)10(d)20(d)30(d)IgM (g/L)0.57±0.180.60±0.210.53±0.200.56±0.17C4 (g/L)0.033±0.0120.032±0.0120.032±0.0090.030±0.010IgG (g/L)8.15±0.608.16±0.658.13±0.508.06±0.65C3 (g/L)0.18±0.020.17±0.020.19±0.030.19±0.03

2.2 飼喂劑量對(duì)疲勞和免疫的影響

研究表明，K+濃度隨著添加量的增加有略微的波動(dòng)，在添加300 mg/kg時(shí)達(dá)到最高值，但各組間差異不顯著(P>0.05)。Ca2+濃度隨著大蒜素添加量的增加出現(xiàn)了一定的降低現(xiàn)象，差異不顯著(P>0.05)。AST活性在添加500 mg/kg時(shí)顯著高于添加100 mg/kg時(shí)(P<0.05)，添加300 mg/kg和0 mg/kg時(shí)與添加100 mg/kg和500 mg/kg時(shí)差異均不顯著(P>0.05)。ALT活性在添加500 mg/kg時(shí)最高，但各劑量組中差異不顯著(P>0.05)。CK活性在添加100 mg/kg時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，添加300 mg/kg和添加500 mg/kg時(shí)與其余各組間差異不顯著(P>0.05)。CK-MB活性在添加300 mg/kg時(shí)極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，添加500 mg/kg時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，添加100 mg/kg時(shí)與對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)。LDH活性在添加500 mg/kg時(shí)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，添加300 mg/kg時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，添加100 mg/kg時(shí)與對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)。LAC活性在對(duì)照組略微高于其他劑量組，但差異不顯著(P>0.05)，且乳酸值在100 mg/kg組，300 mg/kg組與500 mg/kg組相互之間差異不顯著(P>0.05)。表3

研究表明免疫球蛋白M濃度在添加100、300和500 mg/kg時(shí)均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，但各組間差異兩兩間均不顯著(P>0.05)。補(bǔ)體C4濃度在添加300 mg/kg時(shí)極顯著高于添加100 mg/kg時(shí)和對(duì)照組(P<0.01)，顯著高于添加500 mg/kg(P<0.05)，添加100、500 mg/kg和對(duì)照組兩兩間差異均不顯著(P>0.05)。免疫球蛋白G和補(bǔ)體C3濃度隨著大蒜素的增加呈現(xiàn)一定的波動(dòng)，但各組間差異不顯著(P>0.05)。表4

表3 血漿中電解質(zhì)及生化指標(biāo)變化隨補(bǔ)飼濃度變化
Table 3 Changes of electrolyte and biochemical index in plasma with the change of supplementary feeding concentration

0 mg/kg100 mg/kg300 mg/kg500 mg/kgK+ (mmol/L)5.32±0.955.49±1.816.28±2.585.28±1.31Ca2+ (mmol/L)3.17±0.183.07±0.143.09±0.103.08±0.16AST (IU/L )582.9±300.19ab411.25±85.03b517.91±196.20ab633.92±257.61aALT (IU/L)19.80±10.2019.00±5.9716.45±4.3423.50±12.02CK (U/L)511.5±350.82a348.44±96.18b383.09±247.15ab388.00±171.52abCK-MB (U/L)407.80±85.20Aa358.00±94.51ABab313.91±76.70Bb322.17±41.38ABbLDH (U/L)406.80±55.62Bb456.06±79.87ABab481.27±99.79ABa515.50±72.75AaLAC (mmol/L)20.14±1.5918.17±4.8218.72±2.0818.08±2.79

表4 血漿中免疫指標(biāo)隨補(bǔ)飼濃度的變化
Table 4 changes of immune index in plasma with supplementary feeding concentration

0 mg/kg100 mg/kg300 mg/kg500 mg/kgIgM (g/L)0.37±0.05B0.57±0.20A0.58±0.08A0.69±0.18AC4 (g/L)0.029±0.006Bb0.029±0.011Bb0.043±0.005Aa0.033±0.008ABbIgG (g/L)8.17±0.368.32±0.718.12±0.417.84±0.64C3 (g/L)0.18±0.020.19±0.020.18±0.020.18±0.04

3 討 論

3.1 飼喂時(shí)間對(duì)疲勞和免疫的影響

疲勞的產(chǎn)生機(jī)制比較復(fù)雜，其涉及到神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的功能協(xié)調(diào)，是一個(gè)周而復(fù)始的循環(huán)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中每一個(gè)環(huán)節(jié)都有可能嚴(yán)重影響到疲勞的發(fā)生和疲勞的程度，測(cè)定運(yùn)動(dòng)后K+、Ca2+濃度水平可用于評(píng)價(jià)動(dòng)物機(jī)體的損傷程度與疲勞程度[8]，K+通道是心臟電位活動(dòng)中比較重要的離子通道之一，構(gòu)成心肌細(xì)胞靜息電位和動(dòng)作電位復(fù)極的主要離子流，大蒜素可能阻滯心房肌細(xì)胞上的超極化激活的延遲整流鉀電流，并且大蒜素的抗氧化作用也能減輕細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載情況，緩解與鈣離子超載相關(guān)的缺血再灌注損傷，從而能夠抑制大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后K+、Ca2+大量滲透到細(xì)胞外的現(xiàn)象[9]，試驗(yàn)結(jié)果與其研究類似。

ALT與AST廣泛分布在動(dòng)物肌細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)，在正常情況下血清中ALT與AST含量穩(wěn)定于一定水平。有研究證實(shí)，短跑運(yùn)動(dòng)員在不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練下，血清AST、ALT的活性均有所增強(qiáng)[10]。劉敏等[11,12]研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加大蒜素干粉，可以使哈薩克羊血清中AST、ALT檢測(cè)值呈現(xiàn)顯著性升高，但在正常范圍之內(nèi)，未對(duì)肝臟與肌肉等組織造成較大損傷。在補(bǔ)飼大蒜素后，血清AST、ALT均有所增加。

LDH對(duì)機(jī)體在缺氧狀態(tài)下運(yùn)動(dòng)時(shí)能量的產(chǎn)生、供應(yīng)以及乳酸代謝都有著十分重要的意義，所以LDH濃度高低可用來評(píng)價(jià)肌肉組織的無氧代謝能力，作為無氧氧化的標(biāo)志酶[13]。金宏等[14]研究，在對(duì)大鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練后，發(fā)現(xiàn)大鼠在運(yùn)動(dòng)后 LDH濃度明顯上升，試驗(yàn)隨著正常訓(xùn)練LDH濃度逐漸增高與前人研究相符。LAC被作為判斷疲勞程度的重要指標(biāo)之一[15]，用于評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)馬的運(yùn)動(dòng)性能[16]。LAC主要是由劇烈活動(dòng)的骨骼肌細(xì)胞產(chǎn)生，彌散出胞膜后在體液中被稀釋轉(zhuǎn)運(yùn)到體內(nèi)其他部位進(jìn)行代謝。LAC作為體液的一部分，其濃度值取決于肌纖維細(xì)胞產(chǎn)生LAC的速度，同時(shí)還取決于LAC的彌散情況及糖異生轉(zhuǎn)換的速度等。李玉娟等[17]研究表明在缺氧狀態(tài)情況下，加用一定量的大蒜素干預(yù)后，乏氧狀態(tài)得到明顯改善，大蒜素有改善細(xì)胞缺氧狀態(tài)的作用，長時(shí)間的大蒜素補(bǔ)飼有助于降低賽后LAC濃度，增強(qiáng)無氧代謝能力，試驗(yàn)結(jié)果與其一致。試驗(yàn)結(jié)果顯示免疫指標(biāo)變化不大，大蒜素的累積效應(yīng)在試驗(yàn)中表現(xiàn)不明顯。

3.2 飼喂劑量對(duì)疲勞和免疫的影響

以不同飼喂劑量分組時(shí)，血漿中各指標(biāo)變化明顯，CK具有一定代表性，CK 參與線粒體呼吸、糖酵解的控制和肌肉收縮供能。通過訓(xùn)練運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加，肌纖維收縮時(shí)產(chǎn)生的牽拉力變大，使細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，致使更多酶分子進(jìn)入血液，會(huì)出現(xiàn)CK濃度升高的現(xiàn)象[18]。CK在不同組織中有不同的表達(dá)，共可分為CK-MM、CK-MB、CK-BB三種亞型，其中在骨骼肌中超過95%是CK-MM形式，其組織特異性能可以準(zhǔn)確地反映骨骼肌細(xì)胞的損傷情況和機(jī)能狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可以減輕離心運(yùn)動(dòng)造成的骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，保護(hù)細(xì)胞膜的通透性和完整性[19]。在大蒜素對(duì)心肌細(xì)胞微損傷的研究中，CK、CK-MB 水平降低，說明大蒜素對(duì)心肌微損傷有一定的保護(hù)作用[20]，試驗(yàn)結(jié)果與前人研究一致。免疫蛋白是衡量機(jī)體免疫功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，在一定范圍內(nèi)血清中的球蛋白含量越高，可以反映出動(dòng)物機(jī)體的抗病能力越強(qiáng)。血清中的球蛋白來源于B細(xì)胞，是機(jī)體內(nèi)抗體的主要表現(xiàn)形式和物質(zhì)基礎(chǔ)，在機(jī)體的體液免疫過程中起主導(dǎo)作用，飼喂大蒜素能夠極顯著提高免疫球蛋白M的含量[21]，試驗(yàn)結(jié)果與其基本一致。補(bǔ)體C4是補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑中的主要成分，它在機(jī)體防御過程中可以清除病原微生物，并通過活化炎性細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用來提高機(jī)體的免疫機(jī)能。黃旭雄等[22]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)飼大蒜素對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的補(bǔ)體C4有顯著的促進(jìn)作用。唐玲[23]在植物添加劑對(duì)鏡鯉作用的研究中發(fā)現(xiàn)，0.5%大蒜莖粉能顯著提高血清C4活性，試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼喂大劑量組大蒜素飼料后，血清C4活性較對(duì)照組顯著增加，與前人研究結(jié)果相近。試驗(yàn)表明大蒜素補(bǔ)飼劑量較高的試驗(yàn)組可以通過提高AST和LDH，降低CK和CK-MB來實(shí)現(xiàn)抗疲勞作用，并且高劑量組可以通過提高免疫球蛋白M和補(bǔ)體C4來增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。添加300～500 mg/kg大蒜素可以有效提升馬匹抗疲勞能力和機(jī)體免疫力。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)通過對(duì)伊犁馬進(jìn)行為期30 d的大蒜素補(bǔ)飼，對(duì)伊犁馬運(yùn)動(dòng)后即刻血液生化指標(biāo)及免疫指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，以大蒜素補(bǔ)飼時(shí)間分組，隨著補(bǔ)飼時(shí)間的推進(jìn)，測(cè)試賽賽后即刻血漿Ca2+、k+，乳酸出現(xiàn)降低現(xiàn)象，AST、ALT、LDH存在階段性上升趨勢(shì)，說明大蒜素的補(bǔ)飼時(shí)間長度對(duì)伊犁馬抗疲勞作用效果更明顯。

以大蒜素補(bǔ)飼量分組，隨著補(bǔ)飼量的增加，測(cè)試賽后即刻血漿AST、LDH出現(xiàn)升高趨勢(shì)，CK、CK-MB呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明大蒜素的補(bǔ)飼量對(duì)伊犁馬抗疲勞作用效果明顯。免疫指標(biāo)免疫球蛋白M、補(bǔ)體C4隨著補(bǔ)飼量的增加呈現(xiàn)明顯的升高趨勢(shì)，說明補(bǔ)飼劑量是大蒜素對(duì)伊犁馬免疫作用的主導(dǎo)因素。伊犁馬合理的大蒜素補(bǔ)飼量建議控制在300～500 mg/kg，對(duì)增強(qiáng)馬匹免疫力和改善馬匹抗疲勞能力效果良好。