曼則熱·朱爾丁，姚力丹，包敖敦格日樂，黃李勇，依明·蘇來曼，決肯·阿尼瓦什

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】哈薩克羊是新疆當?shù)氐拇置?，也是新疆原始綿羊品種之一[1]，是一個肉脂兼用品種。曾經(jīng)是新疆最常見和最普遍的綿羊品種[2]。哈薩克綿羊耐寒，耐粗飼料，抗病性強，對天然牧場環(huán)境條件具有很強的適應性。目前，它已成為一個肉脂兼用型粗毛羊品種，適合在牧場放牧，具有很高的經(jīng)濟價值。MSTN基因?qū)∪獍l(fā)育的抑制作用主要是抑制出生前肌肉發(fā)育和出生后肌肉的肥大生長[3]。哺乳動物DNA的甲基化與基因的表達密切相關。通常，DNA的甲基化與基因表達負相關。甲基化可抑制轉(zhuǎn)錄起始，但不阻止轉(zhuǎn)錄的延伸。這種抑制需要關鍵位點的甲基化，不需要完全甲基化，并且不具有啟動子的甲基化值閡值[4]。對哈薩克羊的遺傳育種提供新的科學依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】肌肉生長抑制素(MSTN)，也被稱為GDF-8(生長分化因子8)，是指可轉(zhuǎn)化生長因子β(tt-ansfot-m ink grow th factor bets TGF-β)超家族，并且是在體內(nèi)廣泛表達的糖蛋白質(zhì)[5]。McPherron[6]等基因敲除用于研究小鼠MSTN基因，結(jié)果表明，突變體純合子比雜合體和野生型重30%，并且肌肉質(zhì)量比野生型大2～3倍。MSTN基因的缺失將導致小鼠的緊湊肌肉發(fā)生突變。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌肉生長抑制素主要存在于骨骼肌中，但它也存在于脂肪組織中，并負責調(diào)節(jié)脂肪前體細胞的分化[7]。McPherron等[6]發(fā)現(xiàn)，肌肉生長抑制素敲除的肌肉在6個月齡后沒有增加體重；而在敲除肌肉生長抑制素的小鼠和野生型大鼠的9～10月齡具有相同的體重。這可能是由于肌肉生長抑制素敲除小鼠的脂肪沉積效率下降。過量的肌肉生長抑制素分泌導致肌肉萎縮和脂肪分解增加，而肌肉生長抑制素的缺少導致肌肉和脂肪減少[7]。在脊椎動物中，DNA的甲基化以DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)的合成為特征，并且甲基在第5個碳原子5'-CpG-3'處合成。次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(HPRT)啟動子中三個特定CpG位點的甲基化對于轉(zhuǎn)錄抑制是具有重要意義，啟動子中其他CpG位點的去甲基化不影響該基因的轉(zhuǎn)錄抑制[4]?！颈狙芯壳腥朦c】目前雖然對MSTN基因的研究有一定的進展，但MSTN基因的DNA甲基化的相關文獻還未見報道。研究以新疆地方綿羊品種哈薩克羊為研究對象，探索MSTN基因在其肌肉中的DNA甲基化水平，為MSTN基因在肌肉中的DNA甲基化水平提供科學的遺傳學資料?！緮M解決的關鍵問題】采用生物信息學分析方法，分析6月齡哈薩克羊的肌肉與脂肪組織的MSTN基因的DNA 甲基化水平，為了解哈薩克羊MSTN基因的DNA甲基化模式奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物

從新疆特克斯縣的牧區(qū)中選出健康的五個6月齡的哈薩克羊。空腹24 h后稱重。立即屠宰，計算了屠體重量和屠宰量。并采取股二頭肌，股三頭肌，半膜肌，最長肌與脂肪組織樣本。

1.1.2 試劑與儀器試劑

Tris飽和酚、氯仿：異戊醇(24:1)、無水乙醇、70%乙醇、Tris堿、硼酸、胰蛋白胨、酵母提取物、嗅化乙錠(EB)、TAKARA公司的DNA methylation goold kit、IPTG、X-GAL、AMP、普通DNA純化試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(均購自TIANGEN公司)，pMD 19-T載體試劑盒(TAKARA公司)，DH5a感受態(tài)細胞，瓊脂糖、均購自新疆寶信生物。

儀器：科技有限公司TGL- 16高速臺式冷凍低溫離心機：湘儀試驗審儀器開發(fā)有限公司，DYY一6C型電泳儀：北京市六一儀器廠，HZS-H水浴振蕩器：哈爾濱市東明公司，HPX-9082 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：上海博訊公司，普通Biomctcrya PCR儀：北京艾思普科技有限公司，Gel Doc 2000型凝膠成像儀:美國Bio-Rad公司。

1.2 方 法

使用在線生物軟件Methprimer (http:// www. urogene. org / methprimer /)篩選出MSTN基因(Gene ID:443449)啟動子區(qū)域CpG島和第1外顯子，并設計BSP引物(P1,和P2)。經(jīng)上海生工生物公司合成后使用滅菌超純水處理，溶解稀釋成10 μmol/L,-20 ℃保存。每個基因的引物序列。表1

表1 引物序列參數(shù)
Table 1 Primer sequence parameters

MSTN基因MSTN gene引物序列Primer sequences/(5'-3')擴增引物長度Product (bp)退火溫度Annealing temp/℃P1F:TATAGTAGTGAGAAGTAGAAAAATGGAATAR: AAATAACAAACATTTCCTCAACTTTC25051.8P2F: TGGAAATAGTTTTTAATATTAGTAAAGATGR: CACTAAAACAACAATCAACAAAAT23050.9

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的質(zhì)量檢測

DNA的質(zhì)量用1%瓊脂糖凝膠檢測。使用微量滴定板讀數(shù)器，使用兩微升來確定純度和濃度。光度比(OD260 / OD280)為1.8～2.0。DNA純度證明是有效的，顯示了清晰的DNA條帶，沒有雜質(zhì)和其他污染物，表明DNA質(zhì)量好可以做后續(xù)試驗。圖1

2.2 普通PCR擴增目的基因

使用亞硫酸氫鹽修飾的DNA進行BSP擴增產(chǎn)物和使用引物P1，P2的PCR陽性克隆的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并使用Gel Doc 2000凝膠成像儀進行顯像，研究表明，目的基因PCR擴增P1,P2片段分別為250 bp，230 bp左右(參照Mark為2000)，左(BSP產(chǎn)物)，右(PCR陽性克隆的產(chǎn)物)，擴增長度大小相同，引物可靠，可以繼續(xù)后續(xù)的試驗。圖2

2.3 DNA甲基化模式分析與序列比對

對哈薩克綿羊不同組織中MSTN基因啟動子區(qū)域的部分片段和外顯子進行DNA甲基化分析。根據(jù)亞硫酸氫鹽檢測的原理，未甲基化的胞嘧啶被修飾為尿嘧啶，而沒有甲基化?；谕蛔冊恚治龉_克羊各種組織的DNA甲基化模型。序列比對結(jié)果顯示總共有15個CpG位點。圖3

注：1.股二頭肌;2.股三頭肌;3.半膜肌;4.半腱肌;5.背最長肌;6.脂肪組織;7. 股二頭肌;8. 背最長肌.

Note：1.Biceps femoris; 2. tricepsfemoris; 3. semimembrane muscle; 4. semitendinosus muscle; 5. longissimusdorsi muscle; 6. adipose tissue; 7. bicepsfemoris; 8. longissimusdorsi

圖1 DNA的瓊脂糖電脈檢測結(jié)果
Fig.1 DNA agarose detection results

注：A為P1引物的BSP擴增圖，B為P1引物的PCR陽性克隆的產(chǎn)物，C為P2引物的BSP擴增圖，D為P2引物的PCR陽性克隆的產(chǎn)物

Note: A is the BSP amplification of the P1 primer, B is the product of the PCR-positive clone of the P1 primer, C is the BSP amplification of the P2 primer, and D is the product of the PCR-positive clone of the P2 primer

圖2 MSTN基因PCR擴增結(jié)果
Fig.2 PCR gene MSTN amplification results

2.4 哈薩克羊MATN基因的DNA甲基化模式分析

使用DNAMAN軟件將測序結(jié)果與原始MSTN基因的DNA序列進行比較，確定目的序列，計算每個組織中甲基化的概率，并計算轉(zhuǎn)化為所有非CpG轉(zhuǎn)化為T的C的百分比確保硫酸脫氨成功的氫鹽。研究表明，經(jīng)序列比對后，計算出哈薩克綿羊各組織中甲基化的概率，黑色圓圈為表示甲基化的CpG位點，空心圓圈為表示未甲基化CpG位點。甲基化結(jié)果顯示：6月齡哈薩克羊肌肉甲基化低甲基化水平，脂肪組織DNA甲基化程度最高，股二頭肌，股三頭肌，半膜肌，半腱肌，背最長肌和脂肪組織的DNA甲基化概率分別為34.7%，22.6%，23.3%，28%，42.6%和76.7%。圖4，圖5

圖3 哈薩克羊MSTN基因DNA甲基化模式比對
Fig.3 DNA methylation pattern alignment of MSTN gene in Kazak sheep

圖4 哈薩克羊MSTN基因的DNA甲基化測序峰
Fig.4 DNA methylation sequencing peak map of Kazak sheep MSTN gene

注:圖中上到下，從左至右分別為股二頭肌，股三頭肌，半膜肌，半腱肌，背最長肌，脂肪組織

Note: From top to bottom in the figure, from left to right are the biceps femoris, triceps femoris, semimembranosus, semitendinosus, longissimusdorsi, adipose tissue

圖5 哈薩克羊MATN基因的DNA甲基化模式
Fig.5 Analysis of DNA Methylation Patterns of MATN Gene in Kazakh Sheep

3 討 論

在真核生物中，一個甲基把在胞嘧啶堿基第5碳上的氫取代，使胞嘧啶甲基化傳 (methylation)。甲基化的胞嘧啶在DNA復制中可整合到正常DNA序列中。胞嘧啶的甲基化通常發(fā)生在CG的二核苷酸序列中。分析表明甲基化可能會降低轉(zhuǎn)錄效率。化學處理后可以進行去甲基化以恢復轉(zhuǎn)錄[9]。DNA的甲基化可以調(diào)節(jié)真核生物的轉(zhuǎn)錄，從而影響基因表達水平。 DNA序列在動物和植物的發(fā)育和分化過程中不發(fā)生變化，但基因表達在發(fā)育的不同階段和不同組織中具有特定的模式。 DNA甲基化和這些與發(fā)育有關的基因的時空表達特征具有密切的關系。一般認為DNA甲基化與基因表達負相關，啟動子區(qū)域的低甲基化可以增加轉(zhuǎn)錄活性，并且基因本身甲基化水平升高也可以降低基因表達水平[10]。申文雯等[11]研究表明，與常規(guī)脂肪小鼠相比，高脂飲食引起的肥胖小鼠脂肪組織的總甲基化顯著增加，而高脂組中n-3 PUFAs升高。該程度顯著低于n-6PUFAs組。 DNMT1，DNMT3a和DNMT3b在脂肪組織中誘導的肥胖小鼠n-6PUFAs的表達顯著高于脂質(zhì)食物小鼠的表達，并且這些三種酶在來自PUFA的脂肪組織n-3中的表達高于脂肪。沒有改變。得出的結(jié)論是，脂肪組織的基因組DNA的甲基化程度隨著肥胖而增加，魚油n-3 PUFA影響DNA甲基化的抑制。侯林等[12]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)5-aza-cdR DNA甲基化抑制劑顯著抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，并顯著改善小鼠的空間學習和記憶。結(jié)果表明，DNA甲基化可能與學習和記憶能力密切相關。Xiao-Long Yuan等[13]對于180 d齡的三只雌性長白×約克夏雜交小母豬中收集三個HPO組織作為研究對象進行試驗，結(jié)果顯示下丘腦(H)，垂體(P)和卵巢(O)的CpG平均甲基化水平分別為57.62%，55.60%和55.44%。姚麗丹等[14]對5月齡的巴什拜羊MSTN基因的DNA甲基化進行研究結(jié)果顯示：5月齡的巴什拜綿羊在股二頭肌，股三頭肌，半腱肌，半膜肌，背最長肌等每個肌肉組織中MSTN基因的DNA甲基化水平非常高，脂肪組織的MSTN基因的DNA甲基化水平較低，股頭二肌，股頭三肌，半腱肌，半膜肌，背最長肌，尾脂組織的MSTN基因DNA甲基化概率分別為74.2%、74.2%、83.2%、83.7%、82.1%和25.3%。分析巴什拜羊各組織MSTN基因表達量與DNA甲基化概率的相關性，分析可知，各組織的甲基化概率都不低，DNA甲基化概率與MSTN基因的總表達量呈顯著負相關(r=-0.48，P<0.05)。與股二頭肌、股三頭肌、半腱肌、半膜肌表達量呈負相關，相關系數(shù)分別為：r=-0.53，r=-0.52，r=-0.54；與背最長肌和脂肪表達量呈顯著負相關(r=-0.87，P<0.05；r=-0.99，P<0.05)。

研究對哈薩克羊的肌肉組織與脂肪組織MATN基因的DNA甲基化模式分析。希望對于哈薩克羊的遺傳提供依據(jù)。實驗中，哈薩克羊各肌肉組織中的MSTN基因的DNA甲基化情況差異不大，脂肪的甲基化概率最高，肌肉組織的甲基化概率較低。股二頭肌，股三頭肌，半膜肌，半腱肌，背最長肌和脂肪組織的DNA甲基化概率分別為34.7%，22.6%，23.3%，28%，42.6%和76.7%。脂肪的甲基化概率是背最長肌，股二頭肌，股三頭肌，半腱肌，半膜肌的甲基化概率分別為：1.8倍，2.2倍，3.39倍，2.74倍，3.29倍。其次甲基化從高到低的依次為：脂肪組織>背最長肌>股二頭肌>半腱肌>半膜肌>股三頭肌。且分析發(fā)現(xiàn)6月齡哈薩克羊各肌肉組織呈底(低)DNA甲基化水平，脂肪組織呈高DNA甲基化水平。研究結(jié)果與姚力丹等[14]研究的5月齡巴什拜羊各肌肉組織呈高DNA甲基化水平，脂肪組織呈底(低)DNA甲基化水平的結(jié)果剛好相反。根據(jù)祖玲玲[15]的對6月齡哈薩克羊的MSTN基因的表達量的研究結(jié)果結(jié)合進行分析。祖玲玲[15]的研究結(jié)果顯示：脂肪組織、背最長肌、股二頭肌、股三頭肌、半腱肌、半膜肌的表達量分別為：3.18、5.15、5.34、4.8、5.37、4.57這與姚力丹[14]對5月齡巴什拜羊各組織MSTN基因表達量的研究結(jié)果(脂肪組織、背最長肌、股二頭肌、股三頭肌、半腱肌、半膜肌的表達量分別為：5.1、0.6、0.4、1.8、0.4、0.95。)也剛好相反。姚力丹[14]研究的結(jié)論為：MSTN基因DNA甲基化與其表達量呈負相關。根據(jù)這結(jié)論可以發(fā)現(xiàn)哈薩克羊與巴什拜羊各組織MSTN基因DNA甲基化水平的差異可能來源于各組織的MSTN基因表達量的差異。需進一步研究探討。

4 結(jié) 論

哈薩克羊各肌肉組織中的MSTN基因的DNA甲基化情況差異不大，脂肪的甲基化概率最高，肌肉組織的甲基化概率較低。股二頭肌，股三頭肌，半膜肌，半腱肌，背最長肌和脂肪組織的DNA甲基化概率分別為 34.7%，22.6%，23.3%，28%，42.6%和76.7%。脂肪的甲基化概率是背最長，股二肌，股三肌，半腱肌，半膜肌的甲基化概率分別為：1.8倍，2.2倍，3.39倍，2.74倍，3.29倍。其次甲基化從高到低的依次為：脂肪組織>背最長肌>股二頭肌>半腱肌>半膜肌>股三頭肌。