盧 洋，王新敏，王小芳，楊 菩，王英姿，鄭志紅，章 樂(lè)*

(石河子大學(xué) 1.醫(yī)學(xué)院；2.病理生理學(xué)教研室；3.第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，4.新疆地方與民族高發(fā)病教育部 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病[1]，深入了解結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制是防治結(jié)核病非常重要的環(huán)節(jié)。MTB是典型的胞內(nèi)致病菌，巨噬細(xì)胞是MTB入侵機(jī)體后機(jī)體免疫系統(tǒng)的第一道防線[2]。巨噬細(xì)胞被MTB感染后，通常會(huì)表現(xiàn)出兩種結(jié)局：壞死和凋亡[3]。壞死可以導(dǎo)致感染的播散，而凋亡則可殺滅寄居于巨噬細(xì)胞內(nèi)的MTB。本課題組前期體內(nèi)研究結(jié)果表明[4- 7]，當(dāng)不同毒力的MTB感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后會(huì)引起B(yǎng)cl- 2家族成員髓細(xì)胞白血病- 1(myeloid cell leukaemia- 1，Mcl- 1)表達(dá)的升高，其在調(diào)控宿主巨噬細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用，MTB感染后Mcl- 1表達(dá)的上調(diào)可能是其逃避宿主巨噬細(xì)胞免疫殺傷的機(jī)制。由于Bcl- 2家族蛋白是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的凋亡調(diào)節(jié)因子[8]，線粒體是其調(diào)控內(nèi)源性凋亡途徑的靶點(diǎn)，因此，本研究擬在體外水平深入探討B(tài)cl- 2家族蛋白在不同毒力的MTB感染后對(duì)宿主巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與細(xì)胞：結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv、結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)無(wú)毒株H37Ra和卡介苗BCG(中國(guó)藥物生物制品檢定所)；新疆地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)強(qiáng)毒結(jié)核分枝桿菌臨床分離株(XJ-MTB)(由本實(shí)驗(yàn)室前期鑒定并保存)。小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))。

1.1.2 主要試劑：Mcl- 1 shRNA質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建[9]，質(zhì)粒的菌液(上海吉?jiǎng)P基因合成)。OPTI-MEM(Gibco公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；流式凋亡試劑盒(Annexin V-APC/7-AAD)(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞總RNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)公司)；Super RT cDNA kit、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher公司)；QuantiFast SYBR Green PCR Kit(Qiagen公司)。兔多克隆抗體Mcl- 1(Santa Cruz公司)；兔單克隆抗體Bax(Cell Signaling Technology公司)；β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體及山羊抗兔IgG(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)與感染模型的建立：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞系。在生物安全柜內(nèi)，用滅菌接種環(huán)挑取羅氏固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3周、狀態(tài)良好的結(jié)核桿菌菌落，置于滅菌磨菌器中，加少量0.05% Tween- 80的0.9%氯化鈉溶液充分研磨，使其成均勻渾濁的菌懸液。用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)細(xì)菌濃度約1×107CFU/mL。感染時(shí)按細(xì)菌∶細(xì)胞=10∶1的比例感染培養(yǎng)好的巨噬細(xì)胞。在菌感染后4 h用PBS清洗巨噬細(xì)胞3次并加入新鮮的完全培養(yǎng)基，此時(shí)計(jì)做感染的0 h。

1.2.2 Mcl- 1 shRNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染：按本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[10]，取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞待匯合到85%開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)取10 μL LipofectamineTM2000稀釋于250 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基中，4 μg質(zhì)粒DNA稀釋于250 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基，室溫放置5 min后將兩者混合，混合后室溫孵育20 min，將500 μL Mcl- 1 shRNA-LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染混合液緩慢加入培養(yǎng)板中培養(yǎng)。4～6 h后更換培養(yǎng)基。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的凋亡率：收集各組巨噬細(xì)胞后根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書操作。

1.2.4 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Mcl- 1、Bax的表達(dá)：感染后12 h收集各組巨噬細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白。SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，半干電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(23 V，40 min)，室溫封閉2 h，一抗兔抗鼠Mcl- 1、Bax以1∶1 000的比例于4 ℃搖床孵育過(guò)夜，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，ECL顯色壓片曝光，β-actin為內(nèi)參。凝膠成像儀分析系統(tǒng)對(duì) Western blot 檢測(cè)條帶進(jìn)行吸光度值掃描。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Bcl- 2家族與凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平：細(xì)胞總RNA的提取按照試劑盒說(shuō)明書操作，分光光度法測(cè)定總RNA含量及濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明將各組細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照QuantiFast SYBR Green PCR Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)各組中Mcl- 1、Bcl- 2、caspase- 3、細(xì)胞色素C的mRNA表達(dá)情況。PCR引物(表1)由上海生物工程公司合成。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同毒力MTB對(duì)小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞凋亡的影響

不同毒力MTB感染組Raw264.7細(xì)胞的凋亡率均顯著增高，且毒力株感染組凋亡率低于無(wú)毒株感染組；靶向下調(diào)Mcl- 1的表達(dá)后，毒力株感染組巨噬細(xì)胞凋亡率分別顯著上調(diào)了37%(XJ-MTB)和34%(H37Rv)(圖1，表2)。

2.2 不同毒力MTB感染小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞后Mcl- 1與Bax蛋白的表達(dá)

毒力株XJ-MTB感染組Mcl- 1的表達(dá)比對(duì)照組升高了0.29倍(P<0.05)；用Mcl- 1 shRNA靶向下調(diào)Mcl- 1的表達(dá)后，H37Ra、H37Rv與XJ-MTB感染組Mcl- 1蛋白表達(dá)分別下降0.54倍、0.5倍和0.68倍(P<0.05)。BCG感染組Bax表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，H37Ra與H37Rv感染組Bax水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；用Mcl- 1 shRNA下調(diào)Mcl- 1的表達(dá)后，各感染組Bax表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，其中XJ-MTB感染組升高最為明顯(圖2)。

2.3 下調(diào)Mcl- 1對(duì)線粒體凋亡通路相關(guān)基因的影響

H37Rv與XJ-MTB感染組Mcl- 1 mRNA水平顯著上調(diào)(P<0.05)；靶向下調(diào)Mcl- 1的表達(dá)后H37Rv與XJ-MTB感染組Mcl- 1基因水平分別下降0.53倍與0.6倍(P<0.05)(圖3A)。XJ-MTB與H37Rv感染Raw264.7細(xì)胞后，促凋亡基因細(xì)胞色素C、caspase- 3以及抑凋亡基因Bcl- 2的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；下調(diào)宿主巨噬細(xì)胞Mcl- 1后，與感染組相比，BCG、H37Ra和H37Rv感染組中Bax水平升高顯著；H37Rv與XJ-MTB感染組Bcl- 2基因水平被顯著下調(diào)；XJ-MTB感染組細(xì)胞色素C表達(dá)顯著升高；BCG與H37Rv感染組caspase- 3表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖3B)。

3 討論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體重要的自穩(wěn)調(diào)節(jié)機(jī)制， MTB的命運(yùn)受到宿主巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控，且宿主巨噬細(xì)胞的凋亡水平與MTB菌株毒力密切相關(guān)。強(qiáng)毒株H37Rv和無(wú)毒株H37Ra感染人肺泡巨噬細(xì)胞，H37Ra感染組的凋亡率顯著高于H37Rv感染組[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒株感染后Raw264.7細(xì)胞的凋亡率顯著低于無(wú)毒株感染組。靶向下調(diào)Mcl- 1的表達(dá)后強(qiáng)毒株感染組Raw264.7細(xì)胞的凋亡率被顯著提高，而且促凋亡效果優(yōu)于BCG與H37Ra感染組，提示Mcl- 1在強(qiáng)毒力的MTB逃逸宿主免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，驗(yàn)證了前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)關(guān)于MTB感染后宿主細(xì)胞內(nèi)Mcl- 1表達(dá)的升高可能是MTB逃逸機(jī)體免疫防御反應(yīng)的機(jī)制[7]的猜想。

表1 引物序列Table 1 Sequences of the primers

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞凋亡率

groupapoptosis rate control4.90±0.78Mcl-1 shRNA8.83±0.49*virulent strain8.40±0.61*#H37Rv9.07±0.81*#H37Ra11.83±0.72*BCG12.20±0.66*virulent strain+ Mcl-1 shRNA12.07±1.20H37Rv+ Mcl-1 shRNA11.33±2.23H37Ra+ Mcl-1 shRNA12.87±0.23BCG+ Mcl-1 shRNA13.30±0.56

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with Mcl- 1 shRNA treated group.

Mcl- 1的主要作用是調(diào)控細(xì)胞凋亡、分化和細(xì)胞周期[12]，并與其他Bcl- 2家族成員共同參與維持線粒體內(nèi)膜的穩(wěn)定[13]。線粒體通路是細(xì)胞凋亡中最經(jīng)典的通路， 線粒體是Bcl- 2家族蛋白調(diào)控內(nèi)在凋亡途徑的靶點(diǎn)[14]。為了可以更詳盡地探討Mcl- 1對(duì)感染不同毒力MTB的小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞凋亡的影響，本研究在基因與蛋白水平檢測(cè)了Bcl- 2家族成員的表達(dá)情況，結(jié)果顯示H37Ra感染后線粒體通路的主要介導(dǎo)者Bax表達(dá)高于毒力株感染組；靶向下調(diào)Mcl- 1的表達(dá)后各感染組Bax水平均顯著增高；同時(shí)，下調(diào)Mcl- 1的表達(dá)可以顯著下調(diào)強(qiáng)毒株感染組Bcl- 2的表達(dá)，并使caspase- 3和細(xì)胞色素C表達(dá)升高。由此可以判斷MTB感染后，Bcl- 2家族成員的表達(dá)受到菌株毒力的影響，強(qiáng)毒株感染可以顯著誘導(dǎo)Bcl- 2家族成員的表達(dá)；并推測(cè)下調(diào)Mcl- 1的表達(dá)激活了宿主細(xì)胞的線粒體凋亡通路，此過(guò)程受到Bcl- 2家族蛋白的調(diào)控。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with untreated group圖2 Western blot檢測(cè)Mcl- 1與Bax蛋白的表達(dá)Fig 2 The protein expression of Mcl- 1 and Bax determined by Western n=3)

A.Mcl-1 mRNA expression; B.Mitochondrial apoptosis pathway associated genes expression;*P<0.05 compared with untreated group；#P<0.05 compared with Mcl- 1 shRNA treated group

綜上，本研究不僅驗(yàn)證了前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)于Mcl- 1在調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡作用的推斷，并推測(cè)靶向下調(diào)MTB感染的宿主巨噬細(xì)胞中Mcl- 1的表達(dá)后，Bcl- 2與Bax等抑/促凋亡蛋白比例失衡導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜通透性改變，Bax從胞質(zhì)移位至線粒體，引發(fā)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞質(zhì)，進(jìn)一步激活線粒體通路下游的caspase- 3引起凋亡，從而殺滅寄居于巨噬細(xì)胞中的MTB，避免感染的播散。本研究為今后結(jié)核病的防治提供了理論基礎(chǔ)。由于結(jié)核病發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，是否有其他通路參與Mcl- 1對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控仍需進(jìn)一步探討。