PKH26標記的人羊膜間充質(zhì)干細胞在宮腔粘連大鼠中的遷移示蹤

陽媛，毛艷華，王佳，孫聰聰，張應鳳，陳芯培

重慶醫(yī)科大學附屬大學城醫(yī)院 婦產(chǎn)科，重慶 401331

目前，宮腔粘連的治療仍是婦產(chǎn)科疾病的重大難題之一。近年來，有研究表明間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cell，MSC) 可成功修復受損的子宮內(nèi)膜[1]。其中人羊膜間充質(zhì)干細胞(Human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs) 可從健康剖宮產(chǎn)婦廢棄胎盤最內(nèi)層的羊膜組織中分離培養(yǎng)獲得，具有來源充足、無創(chuàng)傷性、無倫理學的問題、自我增殖能力強、低免疫原性和多向分化潛能等優(yōu)勢[2-6]，成為更為理想的細胞移植的來源[7]，為治療宮腔粘連帶來了新的思路。然而，hAMSCs移植人體內(nèi)以后的去處以及其發(fā)揮的治療作用尚不清楚。因此，提供一個簡便有效的體內(nèi)示蹤方法，研究移植細胞在體內(nèi)存活、遷移、分布等已成為干細胞移植研究領域的重要環(huán)節(jié)。大量研究表明 PKH26染料標記人臍帶間充質(zhì)干細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞等的示蹤研究[8-10]。然而 PKH26標記的 hAMSCs在大鼠宮腔粘連子宮內(nèi)膜的遷移示蹤情況的報道較少。本研究采用PKH26對hAMSCs進行體外標記，觀察其對細胞形態(tài)、增殖、活性、周期等生物學特征的影響，并通過尾靜脈移植于宮腔粘連大鼠體內(nèi)，觀察其在大鼠子宮內(nèi)膜組織中遷移情況，為 hAMSCs移植治療宮腔粘連的研究提供一個有效的示蹤方法，為下一步研究hAMSCs移植的作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 羊膜來源

取自重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，獲得產(chǎn)婦同意且排除各種傳染性疾病的正常足月剖宮產(chǎn)分娩的胎盤，于無菌條件下剝離羊膜組織。本實驗經(jīng)重慶醫(yī)科大學倫理委員會(20141230) 批準，所有方法均按照有關規(guī)定執(zhí)行。

1.1.2 實驗動物

選取SPF級健康雌性SD大鼠15只，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。體質(zhì)量220–250 g，每5只一籠，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 hAMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定

無菌條件下剝離羊膜組織，用PBS反復沖洗除去殘留血液及絨毛膜并將其剪成約 1 mm×1 mm×1 mm組織碎塊。加入 0.05%胰蛋白酶于37 ℃水浴鍋中消化30 min，反復2次，離心棄上清液。然后加入0.1 mg/mLⅠ型膠原酶37 ℃消化1 h。200目細胞篩過濾，收集細胞濾液，離心、培養(yǎng)于含12%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。2–3 d更換培養(yǎng)基一次，待細胞長至 85%–90%融合時傳代。取第3代細胞用流式細胞儀檢測細胞膜免疫表型CD29、CD34、CD90、HLA-DR的表達，并做陰性對照檢測；用免疫熒光檢測hAMSCs間充質(zhì)細胞標志物波形蛋白和上皮細胞標志物角蛋白的表達。

1.2.2 PKH26標記羊膜間充質(zhì)干細胞

取第3代hAMSCs消化成單細胞懸液，用PBS清洗一遍，離心，小心棄上清液(剩余上層細胞體積不多于 25 μL)。按照 PKH26(Sigma公司) 試劑盒說明書加入1 mL稀釋液C，輕輕吹打混勻制成細胞懸液。在染色前，配置好4×10–6mol/L染色工作液，快速將細胞懸液加入到染色液中充分混勻孵育1–5 min。加入2 mL的血清終止反應，孵育 1 min以結合多余染液。離心棄上清，用10 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，移至另一新的離心管中，反復清洗2遍。重懸至實驗所需的細胞濃度。細胞涂片，熒光鏡下觀察細胞，計算熒光標記率。將細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，觀察單次標記后在體外檢測到PKH26熒光的時間，每次傳代前于熒光鏡下觀察顯色情況。

1.2.3 細胞活性和增殖的檢測

取第3代標記和未標記的hAMSCs，用CCK-8試劑盒檢測其活性及增殖能力，計算存活率并繪制生長曲線。按照試劑盒說明書操作每孔加入100 μL(含細胞數(shù)約為1 000個) 細胞懸液接種于96孔板中。每次取5孔檢測hAMSCs活性，重復3次；每天相同時間取3孔，共6 d檢測細胞的增殖能力。用全自動酶標儀檢測 450 nm處的吸光度，取均值。存活率=(標記組OD值–空白孔OD值)/(未標記組OD值–空白孔OD值)；以培養(yǎng)時間為橫坐標、相應的吸光度值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.4 細胞周期和凋亡的檢測

取第3代標記和未標記的hAMSCs，用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率。

1.2.5 建立大鼠宮腔粘連模型

參照蔡慧華等[11]的方法建模。選用15只SD大鼠，隨機分為3組，每組5只。每日上午經(jīng)陰道涂片檢查，確認有動情周期?？瞻讓φ战M不予處理；實驗組建立宮腔粘連模型，腹腔注射5%、2 mL/只的水合氯醛麻醉。嚴格遵守無菌原則，于大鼠的下腹正中部縱行切開一長約 3–4 cm的切口，分離組織進入腹腔，暴露子宮。在距宮體交界處1 cm的左宮角橫切開一微小切口，自該切口用自制的小刮勺向?qū)m角遠端搔刮左側子宮腔4圈，搔刮長度約4 cm，停止搔刮。于宮腔內(nèi)留置已備好的脂多糖棉線，同法處理右側子宮角。生理鹽水沖洗腹腔，縫合切口。留置約2 cm的棉線殘端于腹部，2 d后輕拉尾絲，取出宮內(nèi)棉線，建模后經(jīng)尾靜脈移植1 mL PKH26標記的hAMSCs(含2×106個)；實驗對照組按實驗組方法建模，建模后經(jīng)尾靜脈注射等體積的PBS液。

1.2.6 熒光共聚焦顯微鏡下觀察 hAMSCs在大鼠子宮內(nèi)膜中的分布

hAMSCs移植后14 d，收集大鼠子宮組織行冰凍切片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察PKH26標記的hAMSCs在子宮中的分布情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用x±s表示，檢驗水準α=0.05，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 hAMSCs形態(tài)觀察、表面標志物特征及PKH26標記效果

hAMSCs貼壁生長，形態(tài)呈梭形或多角形，排列緊密，胞體拉伸，單層放射狀或漩渦狀生長，傳代后細胞增殖迅速，約3–4 d可鋪滿全層(圖1)。流式細胞儀檢測 hAMSCs高表達 CD29、CD90(95%以上)，幾乎不表達 CD34、HLA-DR(圖 2)，類似于文獻報道的間充質(zhì)干細胞的表型表達[9]。免疫熒光染色顯示hAMSCs表達波形蛋白，而不表達角蛋白(圖3)，說明提取的hAMSCs純度較高。PKH26標記陽性率100%；CCK-8檢測顯示標記細胞的存活率高達99%。第3代hAMSCs首次PKH26染色后，經(jīng)過4次傳代，每代3–5 d，隨著細胞的傳代熒光強度逐漸減弱(圖4)。

2.2 hAMSCs標記組與未標記組的細胞增殖能力的檢測

CCK-8檢測對兩組細胞進行細胞增殖能力的檢測，結果顯示：第3–5天細胞增殖速度較快，為對數(shù)增長期；之后細胞生長進入平臺期。兩組差異無統(tǒng)計學意義(t=0.924 5)(圖5)。

2.3 hAMSCs標記組與未標記組的細胞凋亡檢測

對兩組的各類細胞比例行獨立樣本t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.878 9)，說明PKH26標記hAMSCs不影響細胞的凋亡(圖6)。

圖1 人羊膜間充質(zhì)干細胞在顯微鏡下的形態(tài)Fig.1 Morphology of human amniotic mesenchymal stem cells under microscope.(A) The primary cells in the third day.(B) Cells after passage.

圖2 人羊膜間充質(zhì)干細胞免疫表型測定Fig.2 The immunophenotype of human amniotic mesenchymal stem cells.(A) CD29(99.60%,positive).(B) CD90(98.69%,positive).(C) CD34(0.45%,negative).(D) HLA-DR(1.04%,negative).

2.4 hAMSCs標記組與未標記組細胞的周期檢測

兩組的大部分細胞處于 DNA合成前期(G1期)，少數(shù)細胞處于DNA復制期(S期)、DNA合成后期(G2) 和有絲分裂期(M期)。兩組各期的細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P=0.980 3)，說明PKH26標記hAMSCs不影響細胞的周期(圖7)。

2.5 hAMSCs移植后在子宮中的分布情況

熒光共聚焦顯微鏡下可見 PKH26標記陽性的hAMSCs散在分布在大鼠子宮內(nèi)膜中，呈紅色熒光。對照組和實驗對照組基本未見紅色熒光(圖 8)。

圖3 人羊膜間充質(zhì)干細胞波形蛋白(A)、角蛋白(B) 的表達情況Fig.3 Expression of vimentin(A) and keratin(B) in amniotic mesenchymal stem cells.

圖4 PKH26標記的人羊膜間充質(zhì)干細胞Fig.4 Human amniotic mesenchymal stem cells labeled by PKH26.(A) P3 generation cells stained for the first time by PKH26.(B-E) Fluorescence staining of 2,3,4 and 5 passages cells.

圖5 人羊膜間充質(zhì)干細胞 PKH26標記組和未標記組的細胞增殖檢測Fig.5 Cell proliferation of human amniotic mesenchymal stem cells in PKH26 and unmarked groups.

圖6 人羊膜間充質(zhì)干細胞PKH26標記組和未標記組的細胞凋亡檢測Fig.6 Cell apoptosis detection of human amniotic mesenchymal stem cells in PKH26 and unmarked groups.

圖7 人羊膜間充質(zhì)干細胞PKH26標記組和未標記組的細胞周期檢測Fig.7 Cell cycle detection of human amniotic mesenchymal stem cells in PKH26 and unmarked groups.

圖8 熒光共聚焦顯微鏡下觀察 PKH26標記的hAMSCs在大鼠子宮內(nèi)膜的分布情況Fig.8 Distribution of PKH26 labeled hAMSCs in the endometrium of rats under the fluorescence confocal microscopy.(A,B) Experimental group.(C) Experimental control group.(D) Control group.

3 討論

本課題組人員臨床研究發(fā)現(xiàn)羊膜移植可有效改善宮腔粘連患者術后再粘連、月經(jīng)等情況[12]，但其中的作用機制尚不清楚。有學者認為宮腔粘連的形成可能與子宮內(nèi)膜基層干細胞功能受損和數(shù)量減少甚至缺失有關[13]，而子宮內(nèi)膜的再生修復需要一定數(shù)量的子宮內(nèi)膜干細胞[14]。目前已有研究證實羊膜中含有干細胞樣細胞，且整張羊膜可產(chǎn)生高達4×108個hAMSCs[15]。羊膜間充質(zhì)干細胞具有自我更新、較強的分化潛能，在體外可向胰島樣細胞(內(nèi)胚層)[16]、成骨細胞、脂肪細胞(中胚層)[17]、神經(jīng)細胞(外胚層)[18-19]等 3個胚層的不同類型細胞分化。多項研究也表明 hAMSCs是修復重建受損組織、器官功能的理想種子細胞[20]。因此，如何選用一種簡便、有效的方法標記hAMSCs，了解其在體內(nèi)遷移及修復子宮內(nèi)膜的機制是亟待解決的問題。

PKH26是一種熒光染料，具有親脂性，可與細胞膜的脂質(zhì)雙分子層發(fā)生不可逆的結合，產(chǎn)生紅色熒光，標記物可隨細胞分裂平均分配給子細胞。目前廣泛用于多種細胞或其他含顆粒胞膜的標記[21-23]，對細胞無明顯毒副作用[24]，不影響細胞原有的生物學特性[25]，且可重復性好。既往實驗表明，細胞移植后PKH26染料不會在已標記和未標記的細胞間傳遞，且不會從凋亡或死亡的細胞中釋放出來，可精確區(qū)分移植細胞和宿主細胞[21]。PKH26能穩(wěn)定存留于體內(nèi)6個月[26]，甚至有標記神經(jīng)干細胞超過1年的記錄[21]，目前成為研究細胞遷移示蹤的理想工具。

因此，本研究對 hAMSCs進行 PKH26熒光標記。標記后細胞形態(tài)和細胞生長狀態(tài)、細胞周期和凋亡均無明顯變化。CCK-8實驗檢測PKH26標記后細胞存活率＞95%，表明該染料不影響細胞的活性，無細胞毒性作用。PKH26首次標記后，熒光強度隨著細胞傳代逐漸減弱，這可能與染料隨著細胞分裂平均分配到子代細胞有關[27]。標記的細胞經(jīng)過4次傳代仍可觀察到熒光顯色，這說明標記的hAMSCs至少在20 d內(nèi)可以被檢測出。此外，hAMSCs移植后2周在實驗組大鼠的子宮內(nèi)膜層可觀察到紅色熒光，而在對照組和實驗對照組未見紅色熒光。由此推測，受損的子宮可能啟動了體內(nèi)的某些信號系統(tǒng)，當hAMSCs移植入體內(nèi)后，經(jīng)血遷移至子宮，并停留于此。然而本實驗只觀察了hAMSCs移植后2周的子宮組織情況，在今后的研究中，將繼續(xù)觀察hAMSCs在體內(nèi)遠期的遷移、增殖分化情況，并檢測 hAMSCs對宮腔粘連的治療效果及作用機制。