趙曉陽，鄧立志，鄧宇斌，萬勇，張黎明

1 中山大學附屬第一醫(yī)院 脊柱外科，廣東 廣州 510080

2 中山大學 材料科學與工程學院，廣東 廣州 510080

3 中山大學附屬第七醫(yī)院 骨科研究中心，廣東 深圳 518107

神經(jīng)干細胞(Neural stem cells,NSCs) 具有向神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞分化的能力[1]，在中樞系統(tǒng)損傷疾病(例如脊髓損傷、腦梗死等) 中移植NSCs可以與宿主損傷的組織整合，替代丟失的細胞，宿主神經(jīng)元可以與移植神經(jīng)干細胞分化的神經(jīng)元形成突觸連接，重建局部神經(jīng)環(huán)路，在利用NSCs移植治療大鼠脊髓損傷實驗中，可觀察到大鼠不同程度的運動功能恢復[2-3]。然而神經(jīng)干細胞移植治療面臨一大障礙，即移植的 NSCs有限的神經(jīng)元分化率與較低的存活率的問題[4]。

絲素蛋白(Silk)作為天然生物材料具有良好的生物相容性[5]，其最終的降解產(chǎn)物是可被身體吸收的氨基酸和寡肽[6]。在許多研究中，將絲素蛋白作為生物材料支架能夠促進嗅鞘細胞和干細胞生長和分化[7-9]。然而絲素蛋白大部分為惰性蛋白，細胞對其黏附能力不強，導致其作為搭載細胞的生物材料支架作用受限。

左旋聚賴氨酸(poly(l-lysine)) ,PLL) 不僅可以提供細胞的黏附位點，其本身還具有正電荷可以促進細胞的黏附、增殖和分化，已有實驗表明將PLL與水凝膠相連可以促進神經(jīng)細胞的黏附并提高細胞活力[10-11]。

綜上所述，我們結(jié)合兩種材料的優(yōu)勢，用聚賴氨酸修飾絲素蛋白膜，并以 NSCs作為種子細胞，觀察其在聚賴氨酸修飾的絲素蛋白膜上的生長和和分化情況，尋找適合中樞神經(jīng)組織工程的支架材料，為中樞神經(jīng)損傷后的再生和修復提供實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料合成部分

1.1.1 原料與試劑

桑蠶繭(Bombyx morisilkworm Cocoon)，購自南寧東桑西移絲綢有限公司；碳酸鈉、乙酸乙酯、碳酸氫鈉、無水硫酸鎂、溴化鉀、四氫呋喃均為分析純，購自廣州化學試劑廠；Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸(Nε-Carbobenzoxy-L-lysine)，二(三氯甲基)碳酸酯(三光氣)，二甲基亞砜(99.7%，Extra Dry，with molecular sieves，Water≤50 ppm)，均購自薩恩化學技術(shù)(上海)有限公司；除四氫呋喃使用前經(jīng)金屬鈉回流除水外，其余均直接使用。

1.1.2 測試方法

1H NMR測試：端基為N-Boc-苯胺的聚賴氨酸芐酯(B-Aniline-PLL) 溶于氘代三氟乙酸(CF3COOD) 和氘代氯仿(CDCl3) 混合溶劑(V(CF3COOD)∶V(CDCl3)=15∶85)， 濃 度 為10 mg/mL。脫保護的帶苯胺端基的聚賴氨酸(Aniline-PIL)、絲素蛋白(Silk) 和絲素蛋白-聚賴氨酸接枝物(Silk-PIL) 凍干樣品溶于重水，樣品濃度為10 mg/mL，利用400 M超導核磁共振譜儀Bruker AVANCE 400(Bruker Co.，Switzerland) 對樣品結(jié)構(gòu)進行1H NMR表征。

UV-vis測試：用紫外-可見雙光束分光光度計(TU-1901，北京普析通用) 測量再生絲素蛋白水溶液與接枝聚賴氨酸絲素溶液的 UV-vis吸收光譜，掃描范圍：300-600 nm。

GPC測試：利用凝膠滲透色譜儀 Waters Breeze GPC(Waters Co.，USA) 測量分子量以及分子量分布系數(shù)。實驗條件：選用Waters ultrastyragel色譜柱和2417型示差檢測器，流動相為色譜純級DMF(含0.01 mol/L LiBr)，柱溫為50 ℃，流速為1 mL/min。

掃面電鏡(SEM) 觀察：用掃面電鏡(OXFORD，Quanta400F) 檢測制備的絲蛋白膜表面結(jié)構(gòu)。

1.1.3 再生絲素原液的制備

按浴比1∶50將蠶繭加入0.02 mol/L的碳酸鈉溶液中，煮沸30 min，用去離子水漂洗，上述步驟重復兩遍，然后用溫水漂洗兩次，擰干扯松，鼓風干燥箱60 ℃干燥。按15%(W/V) 的比例將絲素蛋白溶于9.3 mol/L 的LiBr溶液，60 ℃溶解1 h，裝入截留分子量為3 500 Da的纖維素透析袋，25 ℃透析3 d，每6 h換一次水，然后置于pH為9的硼酸緩沖液透析1 d，4 ℃保存。

1.1.4 帶苯胺端基的聚賴氨酸(Aniline-PIL) 的合成

將5.0 g Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸分散于50 mL經(jīng)NaH除水處理的四氫呋喃，氬氣保護下，加熱至55 ℃，加入3.5 g 三光氣，反應(yīng)1 h，旋蒸除去溶劑，加入100 mL乙酸乙酯溶解，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌3次，分離出有機相，用無水硫酸鎂干燥24 h，過濾后旋蒸除去乙酸乙酯，得到Nε-芐氧羰基賴氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐(zLL-NCA)。

將1.6 g 單體Nε-芐氧羰基賴氨酸-N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐溶于30 mL DMF，加入73 mg 的引發(fā)劑N-Boc-苯胺，單體與引發(fā)劑的比例([M0]/[I0]) 為30，通氮氣保護，25 ℃反應(yīng)3 d，反應(yīng)結(jié)束，裝入截留分子量為3 500 Da的纖維素透析袋，去離子水中透析2 d除去DMF，得到端基為 N-Boc-苯胺的聚Nε-芐氧羰基賴氨酸(B-Aniline-PzLL)。冰浴下，按照100 mg/mL TFA的濃度將B-Aniline-PzLL溶于三氟乙酸，滴加1/3三氟乙酸體積的氫溴酸，滴加完畢后撤去冰浴，室溫反應(yīng)2 h，旋蒸除去三氟乙酸和氫溴酸，加適量去離子水溶解，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液中和多余的酸，透析3 d，凍干得到帶苯胺端基的聚賴氨酸(Aniline-PIL) ，反應(yīng)路線(圖1A)。

1.1.5 聚賴氨酸修飾絲素蛋白的制備

將40 mg帶苯胺端基的聚賴氨酸(Aniline-PIL)，溶于2.5 mL純水，加入1.25 mL對甲苯磺酸一水合物(0.10 mmol) 溶液，滴加1.25 mL的亞硝酸鈉(0.05 mmol) 水溶液，反應(yīng)10 min，上述溶液混合均在冰浴中進行，加入20 mL 經(jīng)硼酸緩沖液透析處理的再生絲素蛋白水溶液，冰水浴中反應(yīng)30 min，裝入截留分子量為8 000 Da的纖維素透析袋，純水中透析3 d除去鹽和未反應(yīng)的聚賴氨酸，每半天換一次水(圖1B)。

1.1.6 聚賴氨酸修飾絲素蛋白膜的制備

取2 mL 1.1.5制備的聚賴氨酸修飾絲素蛋白水溶液加入24孔板，40 ℃鼓風干燥箱干燥12 h，加入80%的乙醇水溶液，放置20 min誘導絲素蛋白構(gòu)象變化，去掉溶劑，自然干燥，得到穩(wěn)定不水溶的聚賴氨酸修飾的絲素蛋白膜，用于后續(xù)細胞實驗。

1.2 細胞實驗部分

1.2.1 神經(jīng)干細胞(NSCs) 的分離、培養(yǎng)和鑒定

實驗中采取孕 16–18 d胚胎 SD大鼠腦組織(中山大學實驗動物中心，廣州，中國) 在 Hanks平衡鹽溶液中機械切割和分離腦組織，并將細胞懸液以1 000 r/min離心5 min。棄上清，細胞沉淀稀釋成單細胞懸液。將細胞接種于培養(yǎng)瓶(Corning) 中，用 DMEM/F12培養(yǎng)基(含有 2%B27(Gibco)，1%青霉素/鏈霉素，1% L-谷氨酰胺(Gibco)，20 ng/mL成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)(Peprotech) 和 20 ng/mL表皮生長因子(EGF)(Peprotech)) 在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)。用Accutase酶(Millipore) 每周消化傳代。這項研究中均使用第3代NSC進行實驗，實驗之前用免疫熒光進行神經(jīng)干細胞鑒定。

1.2.2 CCK-8檢測

第2代神經(jīng)干細胞球用Accutase酶消化分解為單個細胞，并種植于預先用絲素蛋白膜(Silk)、聚賴氨酸修飾絲素蛋白膜(Silk-PIL) 和多聚賴氨酸(PLL) 包被好的24孔板(Corning) 中，每孔的細胞密度為1×105cells/mL，每孔總體積為1 mL，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)。分別在1、3、5、7 d時加入10 μL CCK8試劑(Jangsu KeyGEN BioTECH Corp.，Ltd)，37 ℃避光孵育3 h，之后將上清液吸入至 96孔板中在 450 nm波長下進行吸光度(OD) 值測定，使用空白對照孔調(diào)零，OD值相對于空白對照組越高表明細胞活力越好，反之則越差。實驗重復3次。

1.2.3 NSCs誘導分化

第2代神經(jīng)干細胞球用Accutase酶消化分解為單個細胞，并種植于預先用絲素蛋白膜(Silk)、多聚賴氨酸(PLL) 和聚賴氨酸修飾絲素蛋白膜(Silk-PIL) 包被好的24孔板(Corning,Acton，MA)中，每孔的細胞密度為1×105cells/mL，每孔總體積為1 mL，在37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)。24 h之后，將原來培養(yǎng)基吸出，換分化培養(yǎng)基(無 EGF和FGF) 培養(yǎng)1周。

1.2.4 免疫熒光染色分析

誘導NSCs分化1周后，將24孔板中的細胞(n=3) 上清液吸去，用PBS洗3遍，每次5 min，之后加入4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗3遍，每次5 min。分別以0.3% Triton X-100透膜和10%山羊血清封閉30 min，去除血清，以適當濃度一抗孵育，4 ℃過夜。次日將標本復溫，PBS洗3次，每次5 min，用熒光二抗于常溫下避光孵育1 h。去除熒光二抗，PBS洗 2次，以 DAPI(Thermo Fisher) 染核15 min。PBS洗2次，將標本置于熒光顯微鏡下觀察。所用一抗如下：神經(jīng)干細胞標志物 Nestin(1∶200，CST)、SOX2(1∶200，CST)、新生神經(jīng)元標志物 β3-tubulin(1∶200，CST)、成熟神經(jīng)元標志物 MAP2(1∶200，CST)。所用二抗如下：FTIC標記羊抗兔或羊抗小鼠抗體(1∶200)。

1.2.5 Western blotting分析

神經(jīng)干細胞分別在不同處理組上培養(yǎng)7 d后進行蛋白提取(n=3)。用RIPA(Santa Cruz) 進行裂解，提出的蛋白用 BCA(Beyotime) 法測其濃度，統(tǒng)一蛋白上樣量為 20 μg，蛋白樣品利用SDS-PAGE(10% Bis-Tris Gel) 進行電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5% BSA進行封閉，一抗4 ℃過夜，對應(yīng)二抗37 ℃孵育1 h，最后以加強化學發(fā)光法顯影(ECL system，Millipore)。所用一抗如下：Bax(1∶1 000，CST)、Bcl-2(1∶1 000，CST)、GAPDH(1∶1 000，CST)。各蛋白水平以GAPDH作為參照。

1.2.6 TUNEL分析

采用TUNEL染色法(Roche，Basel，Swiss)檢測NSCs在不同處理組上培養(yǎng)7 d的細胞凋亡情況。先用 4%多聚甲醛在室溫下固定 10 min，用PBS洗兩次，每次 10 min，接著用 0.2% Triton X-100進行透膜30 min，用PBS洗2次，加TUNEL試劑避光37 ℃孵育1 h，之后用PBS再洗2次，加DAPI染核15 min。熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞分布區(qū)域隨機選取5個不重疊視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)(顯紅色熒光)。

1.2.7 Real-time PCR分析

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF) 是神經(jīng)干細胞分泌的一種營養(yǎng)因子，對神經(jīng)細胞的增殖、分化、存活有重要的影響。神經(jīng)干細胞分別在不同處理組上培養(yǎng) 7 d后，用RT-PCR技術(shù)檢測兩組神經(jīng)干細胞BDNF mRNA水平，具體操作見 RNA提取試劑盒(TaKaRa)、PrimeScript RT Reagent Kit和SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa) 說明書，引物序列見表2。

1.3 統(tǒng)計分析和制圖

所有的統(tǒng)計數(shù)據(jù)用 SPSS 16.0和 GraphPad Prism 6進行統(tǒng)計分析和制圖，結(jié)果用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗。*P＜0.05為顯著，**P＜0.01為極顯著。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖1 聚賴氨酸修飾絲素蛋白合成圖Fig.1 Synthesis of Aniline-PIL modified silk.(A) Synthetic road map of Aniline-PIL.(B) Synthetic road map of Aniline-PIL modified silk.

2 結(jié)果與分析

2.1 聚賴氨酸修飾的絲素蛋白膜的合成

圖 2A是絲素蛋白與經(jīng)聚賴氨酸修飾的絲素蛋白水溶液的紫外-可見光譜圖，兩相比較，經(jīng)聚賴氨酸修飾的絲素蛋白水溶液在352 nm發(fā)生強紫外吸收，393 nm處出現(xiàn)一個肩峰，這兩處的紫外吸收由酪氨酸殘基與苯胺基團偶聯(lián)形成的偶氮苯結(jié)構(gòu)造成[12]，說明聚賴氨酸成功通過化學偶聯(lián)的辦法接枝到絲素蛋白骨架上。圖2B是絲素蛋白和經(jīng)聚賴氨酸修飾絲素蛋白的核磁共振譜圖，與純的絲素蛋白比較，經(jīng)聚賴氨酸修飾的絲素蛋白在δ 3.00附近出現(xiàn)屬于聚賴氨酸重復單元中殘基上亞甲基的質(zhì)子化學位移。與絲素蛋白和經(jīng)聚賴氨酸修飾絲素蛋白溶液的紫外-可見光譜的數(shù)據(jù)一同說明，聚賴氨酸通過酪氨酸殘基與苯胺的反應(yīng)成功接枝到絲素蛋白上。掃描電鏡觀察顯示，絲素蛋白膜呈纖維狀三維立體結(jié)構(gòu)，纖維分布均勻，孔隙大小為5-30 μm(圖2C)。

2.2 神經(jīng)干細胞的鑒定及增殖活性分析

圖2 絲素蛋白膜與經(jīng)聚賴氨酸修飾的絲素蛋白膜的檢測和觀察Fig.2 UV-vis spectra and 1H NMR spectra of Silk and Silk-PIL.(A) UV-vis spectra of Silk and Silk-PIL.(B) 1H NMR spectra of Silk and Silk-PIL.(C) Observation of Silk and Silk-PIL by SEM.

所用細胞經(jīng)免疫熒光檢測均表現(xiàn)為Nestin和SOX2 陽性(圖 3A)，提示所用細胞為 NSCs。NSCs在不同處理組上生長7 d(圖3B)。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，第1天時Silk組(0.150±0.017)，PLL組(0.163±0.036) 與 Silk-PIL 組(0.176±0.03) 的神經(jīng)干細胞增殖能力無明顯差異(P=0.582)，但隨著時間推移，第3天、第5天、第7天3組CCK-8檢測結(jié)果顯示，Silk+PIL 組(0.335±0.039、0.511±0.055、0.671±0.078)相 比 于 Silk 組(0.242±0.030、0.305±0.036、0.408±0.022)，細胞增殖能力顯著提高(P=0.032，P=0.006，P=0.005)，而相比于 PLL組(0.319±0.031、0.435±0.074、0.615±0.063) 并無顯著性差異(圖3C)。

2.3 免疫熒光檢測NSCs分化

在不同材料上誘導NSCs分化7 d后，用免疫熒光的方法檢測 NSCs分化成神經(jīng)元(包括新生神經(jīng)元和成熟神經(jīng)元) 和星型膠質(zhì)細胞的面積(圖 4A)，實驗結(jié)果表明，Silk-PIL組中新生神經(jīng)元標志物 β3-tubulin陽性的細胞面積顯著高于Silk組(P=0.034)，對于成熟神經(jīng)元標志物MAP2來說，Silk-PIL組中陽性細胞面積顯著高于 Silk組(P=0.009)，而相對于 PLL組，無論是新生神經(jīng)元標志物 β3-tubulin還是成熟神經(jīng)元標志物MAP2，兩組之間并無顯著性差異(P=0.541；P=0.347)。三組星形膠質(zhì)細胞標志物 GFAP的陽性面積并無顯著性差異(P=0.753)(圖4B)。

2.4 Western blotting、TUNEL和 Real-time PCR分析

TUNEL檢測結(jié)果表明，Silk組的凋亡細胞數(shù)量要明顯多于 Silk-PIL和 PLL組(P=0.04)(圖5A、D)。Bax為細胞內(nèi)促凋亡蛋白，其表達量增高可導致細胞發(fā)生凋亡，Bcl-2為胞內(nèi)抑制凋亡蛋白，其表達量增高可抑制細胞發(fā)生凋亡，Bax/Bcl-2的高低可反映細胞凋亡程度的高低[13]。在此實驗中，NSCs分別在Silk、PLL和Silk-PIL上培養(yǎng)7 d后，Western blotting檢測了Bax和Bcl-2的表達水平(圖5A)。Silk組Bax/Bcl-2水平顯著高于Silk-PIL組(P=0.024)(圖5B、C)，證明Silk組的 NSCs細胞凋亡程度較 Silk-PIL組高，Silk-PIL與PLL組之間Bax/Bcl-2水平無顯著性差異。通過Real-time PCR發(fā)現(xiàn)Silk-PIL和PLL組NSCs中BDNF的mRNA表達量顯著高于Silk組(P=0.03)(圖 5E)。

圖5 TUNEL檢測凋亡細胞(A、D)、凋亡相關(guān)蛋白Bax和 Bcl-2的表達(B、C) 和神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF mRNA表達情況(E)Fig.5 TUNEL and Western blotting analysis of the levels of apoptotic cells(A,D) and Bax/Bcl-2 apoptosis-related protein(B,C).The levels of BDNF mRNA was detected by Q-PCR(D).Scale bar=100 μm.

3 討論

正如許多研究所述，NSCs能夠自我更新，可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，這種性質(zhì)可以使其補充中樞系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的缺失[14]，從而形成有功能的神經(jīng)回路，其次，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，NSCs也能夠分泌諸多營養(yǎng)因子(如BDNF、NT-3等)，為神經(jīng)和軸突再生提供良好的生存環(huán)境[15]，綜上，NSCs是中樞神經(jīng)后移植修復的種子細胞。但如前文所述，NSCs也有其自身的缺點，如向神經(jīng)元分化少、存活率低等，因此如何用適合的材料攜帶NSCs并促進NSCs在其上的存活和向神經(jīng)元分化是亟待解決的問題。

研究表明，理想的組織工程材料應(yīng)具備以下幾個特性[16]：1) 具有良好的強度和理化性質(zhì)；2)材料來源廣泛且易加工成型，可塑性強；3) 具有良好的生物相容性，其自身及降解產(chǎn)物對細胞和機體無毒性，不會或較少引起炎癥和免疫排斥反應(yīng)；4) 生物降解速率與組織再生速率相匹配，最終可被充分吸收或安全排出體外；5) 良好的表面相容性，有足夠的細胞吸附能力，支持細胞的黏附、生長、增殖、分化。

絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然的高分子纖維蛋白，具有良好的理化特征和生物性能[17-18]。絲素被用作縫合線后，現(xiàn)在又被重新審視作為一種有廣泛應(yīng)用潛能的生物材料而煥發(fā)新生。

有研究者認為絲素蛋白具有以下優(yōu)點：機械強度高、良好的生物相容性、生物降解性緩慢、制備方法多樣易得、能夠支持多種細胞的黏附、分化和生長[19-21]。已有研究實驗將絲素蛋白作為成骨、韌帶、肌腱、血管的組織工程支架，取得了良好的效果[22]。但絲素蛋白也有其自身的缺點，其主要成分為惰性蛋白，作為細胞載體與細胞黏附力較弱。

在此項研究中，我們用NSC作為種子細胞，并用聚賴氨酸修飾絲蛋白，增加絲蛋白中帶正電荷的基團，增加其對細胞的粘附性，觀察其對NSCs增殖和分化的影響。經(jīng)CCK-8檢測結(jié)果顯示，NSCs在用聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上細胞活力增殖速度顯著高于未經(jīng)修飾的絲蛋白膜，Western blotting 檢測也表明NSCs在聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上促凋亡蛋白Bax與抑凋亡蛋白Bcl-2比值顯著低于單純絲蛋白組，證明 NSCs在聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上細胞凋亡更少，存活率更高。免疫熒光檢測NSCs分化結(jié)果表明，NSC在聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上分化的神經(jīng)元數(shù)量顯著多于其在單純絲蛋白膜上的神經(jīng)元數(shù)量，這表明聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜能夠促進 NSCs向神經(jīng)元方向分化。不僅如此，RT-PCR結(jié)果提示，NSC在用聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上BDNF mRNA水平更高。BDNF作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子可以促進神經(jīng)生長，增加神經(jīng)細胞的存活率，并且也有實驗證明，BDNF能夠促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，但向膠質(zhì)細胞方向分化影響不大，這或許是導致 NSCs在聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜上分化的神經(jīng)元數(shù)量顯著多于其在單純絲蛋白膜上的神經(jīng)元數(shù)量而膠質(zhì)細胞數(shù)量卻沒有差異的原因之一[23-24]。同時，實驗組 Silk-PIL在材料上的形態(tài)、數(shù)量、黏附性與PLL組無顯著差異，說明多聚賴氨酸修飾的絲素蛋白能為 NSCs的黏附和生長分化提供良好的生長表面。

應(yīng)用絲蛋白膜作為修復神經(jīng)損傷材料也有其相對的局限性：比如絲蛋白的β折疊結(jié)晶易被破壞，降低了其力學性能[25]；其次，體內(nèi)實驗表明將絲蛋白作為神經(jīng)修復材料在體內(nèi)降解速度較為緩慢[26-27]，神經(jīng)系統(tǒng)中并無絲蛋白成分，將其作為基質(zhì)材料，在體內(nèi)的效果需要進一步觀察。盡管此研究表明用聚賴氨酸修飾的絲蛋白膜可以促進 NSCs增殖并促進其向神經(jīng)元方向分化，但其中的機制還需進一步探究。如果進一步將其作為一種理想的細胞移植支架，尚需觀察其移植體內(nèi)的生物學效應(yīng)，只有對此材料進行全面和綜合的實驗分析評價，才能為其在神經(jīng)再生領(lǐng)域的應(yīng)用提供可靠的實驗依據(jù)。