shRNA干擾長鏈非編碼RNA PVT1對甲狀腺乳頭狀癌IHH-4細胞增殖、凋亡和周期的影響①

常 亮 袁紅敏 趙立言 馬明德

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，開封475000)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，近20年來發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1,2]。甲狀腺癌分為甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺未分化癌3種類型[3]。其中，PTC占所有甲狀腺癌發(fā)病的80%～90%[4]。經(jīng)過手術(shù)、放化療等治療后，大多數(shù)PTC患者預(yù)后較好，但仍有近30%患者會出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移后生存率僅51%[5,6]。家族遺傳、輻射和碘的異常攝入是誘導(dǎo)PTC的主要因素[7,8]。近年來研究表明，基因不穩(wěn)定和基因異常表達在PTC發(fā)病過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[9]。長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA,LncRNA)PVT1(Plasmacytoma variant translocation 1)在多類癌細胞中呈高表達狀態(tài)，在調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[10,11]。但其對PTC細胞增殖、凋亡及周期的影響還較少見報道。本文以PTC細胞IHH-4為研究對象，探討下調(diào)PVT1表達對PTC細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響，以期為臨床PTC的治療研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司。Trizol試劑購自美國Promega公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自美國ThermoFhisher公司。CCK8試劑盒購自武漢默沙克生物技術(shù)公司。PI染色液和FITC-Annexin V購自美國BD公司?？筀i67、Caspase-3和Cyclin A一抗購自英國Abcam公司。HRP標記山羊抗小鼠二抗購自北京博奧森生物科技公司。PVT1 shRNA由漢恒生物科技公司設(shè)計合成，慢病毒包裝也由漢恒生物科技公司完成。PTC細胞株IHH-4購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含有10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)液將IHH-4細胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中，待細胞融合率達到85%時進行傳代培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染前24 h將細胞以1×105傳代培養(yǎng)于24孔板中。將細胞分為IHH-4組、sh-Ctrl組和sh-PVT1組，每組6個復(fù)孔。第2天 sh-PVT1組加入用完全培養(yǎng)液稀釋的慢病毒稀釋液構(gòu)建PVT1低表達的IHH-4細胞，sh-Ctrl組加入不含目的基因的慢病毒，IHH-4組則加入正常培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24 h后更換為正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行檢測。

1.2.2動物分組及甲狀腺乳頭癌腫瘤移植模型復(fù)制 36只裸鼠由昆明中國科學(xué)院動物研究所提供，許可證號SCXK(滇)K2015-0003。將36只裸鼠隨機分為IHH-4組、sh-Ctrl組和sh-PVT1組，分別取轉(zhuǎn)染后的細胞，將細胞密度調(diào)整至2×107個/ml，于裸鼠右前背部皮下注射IHH-4細胞，連續(xù)飼養(yǎng)25 d，每天用游標卡尺測量腫瘤生長情況，計算腫瘤體積(腫瘤體積=長×寬×高/2)。

1.2.3取材 連續(xù)飼養(yǎng)裸鼠25 d后，腹腔注射過量10%水合氯醛處死裸鼠，并立即取出腫瘤，將腫瘤組織置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4RT-PCR檢測PVT1的表達 用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用實時定量PCR試劑盒檢測PVT1表達量，以GAPDH為內(nèi)參。所用到的引物序列如下：PVT1上游引物：5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3′，下游引物：5′-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGGTGGAGCCAAACGGGTC-3′，下游引物：5′-GGAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3′。

1.2.5CCK8檢測細胞增殖 用sh-PVT1轉(zhuǎn)染細胞24 h后，將細胞傳代培養(yǎng)于96孔板中，每組6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)0、1、2、3和4 d后，小心吸去細胞上清液，每孔加入10 μl CCK8試劑，于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h 后，用酶標儀檢測細胞吸光度，測定波長為450 nm。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和細胞周期 用胰酶消化后收集細胞，將細胞密度調(diào)整為1×106個/ml，用結(jié)合緩沖液清洗細胞，重懸沉淀后加入FITC-Annexin V和 PI溶液，室溫避光孵育15 min 后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

用胰酶消化后收集各組細胞，PBS清洗后，加入乙醇溶液于4℃固定30 min。30 min后加入預(yù)冷的PBS清洗細胞，加入PI溶液室溫避光染色30 min，最后用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達 用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測細胞總蛋白濃度。每組取等量蛋白質(zhì)用10%SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，TBST清洗3次后，5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h。封閉完成后加入適宜濃度一抗(Ki67,1∶1 200;Caspase-3,1∶1 000;Cyclin A,1∶1 000)于4℃封閉過夜，第2天小心吸走一抗，清洗PVDF膜后，加入相應(yīng)二抗室溫封閉1 h，滴加ECL顯色液，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖片，用Image J對蛋白質(zhì)表達量進行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1sh-PVT1對IHH-4細胞PVT1表達的影響 與sh-Ctrl組比較，sh-PVT1組IHH-4細胞PVT1表達水平明顯降低(P<0.01，圖1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示轉(zhuǎn)染成功。

2.2sh-PVT1對IHH-4細胞增殖的影響 如圖2所示，sh-PVT1轉(zhuǎn)染細胞后4 d，與sh-Ctrl組比較，sh-PVT1組細胞增殖倍數(shù)顯著降低(P<0.05，圖2)；同時，sh-PVT1組IHH-4細胞Ki67蛋白表達水平明顯低于sh-Ctrl組(P<0.01，圖3)，表明沉默PVT1能抑制IHH-4細胞增殖。

2.3sh-PVT1對IHH-4細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明，sh-PVT1組IHH-4細胞凋亡率與sh-Ctrl組比較明顯升高(P<0.01，圖4)；同時，sh-PVT1還能誘導(dǎo)細胞凋亡標志蛋白Caspase-3表達(P<0.01，圖3)，表明沉默PVT1能誘導(dǎo)甲狀腺乳頭狀癌細胞凋亡。

2.4sh-PVT1對IHH-4細胞周期的影響 與sh-Ctrl組比較，sh-PVT1組G2/M期細胞比例明顯增多，G0/G1期細胞比例有所減少，S期變化不明顯，表明sh-PVT1可顯著誘導(dǎo)IHH-4細胞G2/M期阻滯(P<0.05，圖5)；同時sh-PVT1還能顯著抑制周期蛋白Cyclin A的表達(P<0.01，圖3)，提示沉默PVT1可誘導(dǎo)甲狀腺乳頭狀癌細胞發(fā)生細胞周期阻滯。

圖1 sh-PVT1對IHH-4細胞PVT1表達的影響Fig.1 Effect of sh-PVT1 on expression of PVT1 in IHH-4 cells Note: n=6,vs sh-Ctrl group，**.P<0.01.

圖2 sh-PVT1對IHH-4細胞增殖的影響Fig.2 Effect of sh-PVT1 on cell proliferation of IHH-4 cells Note: n=6,vs sh-Ctrl group，*.P<0.05.

2.5sh-PVT1對腫瘤生長的影響 與IHH-4組比較，sh-Ctrl組裸鼠腫瘤大小無明顯變化；與sh-Ctrl組比較，sh-PVT1組裸鼠腫瘤組織體積顯著減小(P<0.01，圖6)，表明干擾PVT1表達能抑制甲狀腺乳頭瘤的生長。

2.6sh-PVT1對腫瘤組織蛋白表達的影響 Western blot實驗結(jié)果表明，sh-PVT1能顯著抑制甲狀腺乳頭瘤模型裸鼠腫瘤組織細胞增殖相關(guān)蛋白Ki67和細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin A表達(P<0.01，圖7)，還可明顯上調(diào)腫瘤組織細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達水平(P<0.01，圖7)，提示sh-PVT1能抑制腫瘤組織細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期阻滯。

圖3 sh-PVT1對Ki67、Caspase-3和Cyclin A蛋白表達的影響Fig.3 Effects of sh-PVT1 on expressions of Ki67,Caspase-3 and Cyclin ANote: GAPDH was used as loading control.n=6,vs sh-Ctrl group，**.P<0.01.

圖4 sh-PVT1對IHH-4細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of sh-PVT1 on cell apoptosis of IHH-4 cellsNote: n=6,vs sh-Ctrl group，**.P<0.01.

圖5 sh-PVT1對IHH-4細胞周期的影響Fig.5 Effect of sh-PVT1 on cell cycle of IHH-4 cellsNote: n=6,vs sh-Ctrl group，*.P<0.05.

圖6 sh-PVT1對腫瘤生長的影響Fig.6 Effect of sh-PVT1 on tumor growthNote: n=6,vs sh-Ctrl group，**.P<0.01.

圖7 sh-PVT1對腫瘤組織Ki67、Caspase-3和Cyclin A表達的影響Fig.7 Effects of sh-PVT1 on expressions of Ki67,Caspase-3 and Cyclin ANote: n=6,vs sh-Ctrl group，**.P<0.01.

3 討論

近年來大量研究表明，LncRNA在細胞生長和人類的疾病發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12]。LncRNA的異常表達與癌癥的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系[13,14]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA PVT1在正常細胞和組織中表達較少，但在胃癌、肝癌、宮頸癌及黑色素瘤等多種癌細胞中呈高表達狀態(tài)，并可作為診斷癌癥惡化的指標[11,15-17]。也有研究表明，PVT1在IHH-4、FTC-133和8505C三類甲狀腺癌細胞系中表達水平明顯升高[18]。本文研究也發(fā)現(xiàn)PVT1在IHH-4細胞中呈高表達狀態(tài)，表明PVT1可能與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

調(diào)控癌細胞增殖是影響癌癥發(fā)展的關(guān)鍵。研究表明，PVT1在肺癌細胞的高表達與肺細胞的異常增殖有關(guān)，抑制PVT1表達能明顯抑制肺癌細胞增殖[19]。Iden等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PVT1在121例出現(xiàn)癌癥轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者癌組織中均呈高表達狀態(tài)，表明PVT1與宮頸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。在本研究中，我們采用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計合成sh-PVT1，用慢病毒將sh-PVT1轉(zhuǎn)染入IHH-4細胞，采用RT-PCR檢測PVT1的表達水平，發(fā)現(xiàn)sh-PVT1轉(zhuǎn)染細胞后，IHH-4細胞PVT1表達水平顯著降低，表明轉(zhuǎn)染成功。sh-PVT1轉(zhuǎn)染細胞后4 d，IHH-4細胞增殖倍數(shù)和腫瘤生長速度顯著降低，同時sh-PVT1還能明顯抑制IHH-4細胞和腫瘤組織細胞增殖標志蛋白Ki67的表達，表明抑制PVT1表達能抑制IHH-4細胞增殖。

研究表明，PVT1的促癌作用還與其抑制癌細胞凋亡有關(guān)。Wu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PVT1可通過下調(diào)Bcl-2家族蛋白Mcl-1的表達抑制腎癌細胞凋亡，還可通過上調(diào)凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達抑制前列腺癌腫瘤的生長[21]。卵巢癌細胞對順鉑化療抵抗性的形成與PVT1調(diào)控卵巢癌細胞凋亡有關(guān)[22]。但PVT1對甲狀腺癌細胞凋亡的作用還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默PVT1可顯著降低IHH-4細胞凋亡率，同時還能降低癌細胞和腫瘤組織Caspase-3的蛋白表達水平，表明下調(diào)PVT1表達能通過抑制Caspase-3的表達誘導(dǎo)PTC細胞凋亡。

細胞周期阻滯是導(dǎo)致細胞增殖抑制、細胞凋亡的主要原因之一。研究表明，LncRNA可參與癌細胞周期的調(diào)控。Marza等[23]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LncRNA GAS5表達可通過激活BRCA1和p53誘導(dǎo)成神經(jīng)細胞瘤細胞周期阻滯，從而誘導(dǎo)癌細胞凋亡。沉默LncRNA Linc0015能誘導(dǎo)多種胃癌細胞系發(fā)生G1期阻滯，抑制癌細胞凋亡和轉(zhuǎn)移[24]。也有研究表明，PVT1可通過靶向調(diào)控miR-26b表達抑制黑色素瘤細胞發(fā)生G0/G1期細胞周期阻滯[25]。本文研究結(jié)果表明，沉默PVT1表達能顯著增加IHH-4細胞G2/M期的細胞比例，減少處于G0/G1期的細胞比例，對細胞S期無明顯影響，表明sh-PVT1能誘導(dǎo)甲狀腺乳頭狀細胞發(fā)生G2/M期阻滯。Cyclin A是一類真核細胞周期調(diào)控蛋白，主要參與G1-S期和G2/M期細胞周期調(diào)控[26,27]。研究表明，Cyclin A在甲狀腺乳頭狀癌細胞中表達異常增多，表明Cyclin A可能通過調(diào)控細胞周期影響甲狀腺癌的發(fā)展[28]。但PVT1是否能通過調(diào)控Cyclin A的表達影響IHH-4細胞周期分布還未知。本文研究表明，sh-PVT1能顯著下調(diào)IHH-4細胞和腫瘤組織Cyclin A的蛋白表達水平，提示敲除PVT1可能通過抑制Cyclin A的表達誘導(dǎo)IHH-4細胞G2/M期周期阻滯。

綜上所述，sh-PVT1能降低IHH-4細胞增殖倍數(shù)、抑制腫瘤生長、升高癌細胞凋亡率和細胞周期G2/M期細胞比例，并且還能抑制細胞增殖標志蛋白Ki67和周期蛋白Cyclin A的表達，上調(diào)Caspase-3表達水平，表明敲除PVT1能抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖，并能誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期阻滯，從而發(fā)揮抗PTC的作用。本研究初步探究了shRNA干擾PVT1對甲狀腺乳頭狀癌的作用，后期將進一步探究具體作用機制。