心房鈉尿肽對(duì)毛細(xì)支氣管炎小鼠肺組織GATA-3的調(diào)控①

張雪靜 何 瀟 吳福玲 劉良宵 高 萌

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，濱州256600)

毛細(xì)支氣管炎是1歲以下嬰幼兒常見的下呼吸道感染性疾病，呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是其首要病原體，嚴(yán)重的RSV感染是嬰兒住院的主要原因，且與哮喘發(fā)作和發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[1,2]。無(wú)論是人類還是動(dòng)物研究都提示2型輔助T型(T helper type 2，Th2)細(xì)胞免疫應(yīng)答在嬰兒RSV毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，Th1/Th2免疫反應(yīng)的失衡在RSV毛細(xì)支氣管炎的免疫應(yīng)答方面起決定作用，Th2型免疫反應(yīng)中的一個(gè)小的轉(zhuǎn)變是改善肺病理生理學(xué)所必需的[3,4]。GATA-3是Th2細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，使Th2細(xì)胞具有產(chǎn)生IL-4、IL-13和IL-5的能力[5]。心房鈉尿肽(Atrial natriuretic peptide，ANP)信號(hào)主要通過(guò)其作用受體NPRA發(fā)揮作用，NPRA可激活下游信號(hào)而促進(jìn)GATA-3的表達(dá)[6]。本研究通過(guò)建立毛支小鼠模型，霧化吸入ANP，以此研究ANP信號(hào)通路對(duì)Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的影響，為毛支的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/c雄鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；按照隨機(jī)對(duì)照原則分為正常組、RSV組、ANP組和ANP+ANP抑制劑A71915(簡(jiǎn)稱A+A組)，在濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)小鼠飼養(yǎng)室常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2細(xì)胞株 人宮頸癌Hela細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株，用含10%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI1640常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.1.3病毒 RSV A2株由山東省病毒研究所饋贈(zèng)，Hela細(xì)胞增殖病毒。用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50% tissue culture infections dose，TICD50)表示病毒滴度。

1.1.4試劑 ANP為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；A71915為美國(guó)Bachem公司產(chǎn)品；兔抗鼠多克隆抗體β-action、兔抗鼠多克隆抗體GATA-3為武漢三鷹公司產(chǎn)品；小鼠心鈉肽酶聯(lián)免疫試劑盒及小鼠IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒為朗頓公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1小鼠RSV模型的建立 用滴鼻法將100 μl RSV(1×106PFUs)滴入除正常組外其他組小鼠鼻內(nèi)，1次/d，連用2 d[7,8]。毛支模型制備完成后，ANP組：1 μg/g ANP霧化吸入小鼠體內(nèi)；A+A組：0.5 μg/g A71915腹腔注入小鼠體內(nèi)，30 min后按1 μg/g 霧化吸入ANP；正常組與RSV組以等量等體積PBS代替ANP霧化吸入及A71915腹腔注射；1次/d，連續(xù)5 d[6]。

1.2.2支氣管肺泡灌洗液 (Bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 的收集 灌洗液配制：將14.62 mg EDTA干粉溶于100 ml PBS中，取100 mg牛血清白蛋白粉(Bovine serum albumin，BSA)及1 ml配制好的1 ml EDTA溶解于99 ml PBS中，4℃?zhèn)溆?。完成造模后間隔24 h進(jìn)行取材，用0.8 ml灌洗液灌洗氣管，連續(xù)3次，高速離心取上清液。-20℃冰箱保存以待檢測(cè)。

1.2.3肺組織病理觀察 充分麻醉后，無(wú)菌分離小鼠肺組織，取右肺中葉進(jìn)行固定、包埋、切片，HE染色，400倍光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肺組織GATA-3表達(dá) 嚴(yán)格按照免疫組化步驟操作，采用EnVision兩步法染色：石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、高壓熱修復(fù)抗原后，3%H2O2孵育，一抗(兔抗鼠多克隆抗體GATA-3 1∶300)4℃過(guò)夜，二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG)37℃孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，脫水，二甲苯透明封片。陽(yáng)性反應(yīng)為棕黃色顆粒沉著，每張切片隨機(jī)選取10張高倍視野(×400)，用Motic Med 6.0分析圖片，測(cè)定其光密度值(OD值)，取平均光密度值(MOD)。

1.2.5ELISA測(cè)定BALF中ANP、IL-4的水平 嚴(yán)格按照ANP、IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)BALF中ANP、IL-4的含量，用mELISA分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.6Western blot檢測(cè)肺組織中GATA-3蛋白水平 冰上提取肺組織蛋白，測(cè)定蛋白濃度，上樣量60 μg。根據(jù)蛋白kD值配制10%SDS-PAGE分離膠進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到甲醇激活的PVDF膜上，7%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗(兔抗鼠多克隆抗體GATA-3 1∶500)4℃冰箱過(guò)夜，TBST洗膜3次，搖床孵育二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG 1∶5 000)80 min，TBST洗膜3次，暗室曝光。膠片掃描后用Image J分析軟件分析條帶吸光度值(A值)。結(jié)果用AGATA-3/A β-action表示。

2 結(jié)果

2.1小鼠肺組織病理學(xué)分析 正常組：小鼠肺組織支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)正常，未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；RSV組：支氣管黏膜增厚，管腔狹窄，支氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，說(shuō)明毛支模型制備成功；ANP組：與毛支組相比，ANP組支氣管黏膜增厚更加顯著，管腔狹窄更加明顯，支氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更加明顯；A+A組：與ANP組相比，A+A組支氣管黏膜增厚程度減輕，管腔狹窄程度減輕，支氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，見圖1。

2.2GATA-3在肺組織中的表達(dá) 與正常組相比，RSV組、ANP組和A+A組GATA-3表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與RSV組相比，ANP組和A+A組GATA-3蛋白表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ANP組較A+A組表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3肺組織中ANP、IL-4水平 ANP：正常組ANP水平為(51.25±11.25)pg/ml；RSV組ANP水平為(190.32±32.51)pg/ml，較正常組明顯升高(P<0.01)。IL-4：正常組IL-4水平為(22.31±3.52)pg/ml；RSV組IL-4水平為(63.87±5.34)pg/ml，較正常組明顯升高(P<0.01)；ANP組IL-4水平為(98.76±4.86)pg/ml，較RSV組明顯降低(P<0.01)；A+A組IL-4水平為(72.58±6.32)pg/ml，較ANP組明顯降低(P<0.01)。

圖1 肺組織病理改變(HE,×400)Fig.1 Pathological changes of lung tissue(HE,×400)Note: A.Normal group;B.RSV group;C.ANP group;D.A+A group.

圖2 肺組織免疫組化圖Fig.2 Representative GATA-3 immunohistochemical in lung tissueNote: A.Normal group;B.RSV group;C.ANP group;D.A+A group.Compared with RSV group, *.P<0.05.

圖3 Western blot檢測(cè)肺組織GATA-3蛋白變化Fig.3 Changes of GATA-3 protein in lung tissue by Western blotNote: Compared with RSV group, *.P<0.05.

2.4肺組織中GATA-3蛋白的表達(dá)水平 與RSV組相比，正常組小鼠肺組織中GATA-3蛋白表達(dá)降低，ANP組GATA-3蛋白表達(dá)增高，A+A組GATA-3蛋白表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 結(jié)論

RSV感染相關(guān)的毛細(xì)支氣管炎是早產(chǎn)兒和免疫低下嬰幼兒的重大威脅[9]。毛細(xì)支氣管炎可通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致肺功能受損，包括氣道炎性細(xì)胞阻塞氣流，肺組織免疫浸潤(rùn)和肺泡水腫等[10,11]。嬰幼兒嚴(yán)重的毛細(xì)支氣管炎表現(xiàn)出高的GATA-3/T-bet比率，在呼吸道分泌物中表現(xiàn)為高的IL-4/IFN-γ比率，均表明Th2極化[12]。上述研究證明RSV毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程均有Th2細(xì)胞的參與。

Th2細(xì)胞是CD4+輔助性T細(xì)胞(Th)的重要亞群，可分泌IL-4、IL-5和IL-13等因子，是哮喘和其他過(guò)敏性疾病免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖及IgE反應(yīng)，造成嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和杯狀細(xì)胞增生[13]。高水平的GATA-3表達(dá)對(duì)于維持Th2細(xì)胞應(yīng)答是必需的，并且與各種輔助因子協(xié)同作用，對(duì)多種靶基因具有促進(jìn)和抑制作用[14]。IL-4是由分化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生的，也是其分化的關(guān)鍵信號(hào)，在驅(qū)動(dòng)和維持Th2細(xì)胞分化所涉及的大部分通路中起決定作用[15]。RSV感染患兒后，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答，造成Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)化，Th1細(xì)胞/Th2細(xì)胞因子比例嚴(yán)重失調(diào)，表現(xiàn)為IL-4/IFN-γ比例失調(diào)，GATA-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)[16]。研究證明毛細(xì)支氣管炎患兒外周血IL-4水平高于正常組，重度組患兒外周血IL-4高于輕度組，GATA-3蛋白表達(dá)也增高[12,17]。夏倩等[18]通過(guò)體外構(gòu)建RSV持續(xù)感染人氣道上皮細(xì)胞的模型，并與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，免疫熒光發(fā)現(xiàn)RSV感染組IL-4水平明顯高于正常組。陳棱麗等[19]用RSV對(duì)SD大鼠造模，肺組織取材，研究發(fā)現(xiàn)RSV感染組大鼠與正常組相比，肺組織中GATA-3蛋白表達(dá)增高，IL-4水平增高，并與 Th2 型細(xì)胞主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)，以上研究均證明Th2細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)與毛細(xì)支氣管炎密切相關(guān)。本研究中用滴鼻法建立RSV BALB/c小鼠模型，對(duì)肺組織進(jìn)行取材，發(fā)現(xiàn)RSV小鼠組BALF中IL-4水平較正常組明顯升高，肺組織中GATA-3蛋白表達(dá)也增高，這些研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，表明毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病和發(fā)展過(guò)程中Th2細(xì)胞可能起到重要作用。

ANP是利鈉肽家族(Natriuretic peptides，NPs)重要成員，是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)分泌激素，主要通過(guò)其受體NPRA調(diào)節(jié)細(xì)胞一系列的活動(dòng)，如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和炎癥等[20]。最近研究發(fā)現(xiàn)，ANP可在呼吸系統(tǒng)如氣管及肺泡上皮細(xì)胞、胎兒的肺組織和肺靜脈中表達(dá)，說(shuō)明ANP/NPRA信號(hào)可能在呼吸系統(tǒng)中起到重要的免疫調(diào)節(jié)作用，是炎癥治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[6,21]。ANP信號(hào)在氣道上皮中高度表達(dá)，其在肺臟中的免疫調(diào)節(jié)，不僅誘導(dǎo)支氣管舒張，還能引起促炎細(xì)胞因子的升高[22]。Ma等[23]對(duì)OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠建模，發(fā)現(xiàn)NPR-A在肺組織中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，表明NPR-A可能是哮喘炎癥加重的一個(gè)原因，并且還可能影響Th1/Th2平衡并促進(jìn)體外Th2型反應(yīng)。Wang等[24]以ANP短肽為模板制備了ANP分子印跡聚合物納米粒子(MIPNPs)，并測(cè)定了其結(jié)合親和力和選擇性，研究顯示下調(diào)NPR-A的表達(dá)，可以抑制氣道炎癥，減少白細(xì)胞浸潤(rùn)，并將白細(xì)胞從Th2型重新分類為Th1型。

高遠(yuǎn)等[25]在哮喘小鼠模型建立成功后，霧化吸入ANP或腹腔注射A71915，結(jié)果顯示哮喘組肺組織充血水腫和炎癥反應(yīng)較正常組嚴(yán)重，ANP組肺組織充血水腫和炎癥反應(yīng)較哮喘組嚴(yán)重；哮喘組GATA-3在肺組織中的表達(dá)量較正常組顯著增高，ANP組肺組織GATA-3蛋白表達(dá)量較哮喘組顯著增高。本實(shí)驗(yàn)中ANP處理組肺組織中GATA-3蛋白水平顯著增高，說(shuō)明ANP信號(hào)可能通過(guò)GATA-3的表達(dá)參與免疫功能失衡的發(fā)病過(guò)程。馬禮兵等[26]通過(guò)建立過(guò)敏性哮喘模型檢測(cè)ANP變化，研究顯示ANP組GATA-3及IL-4等表達(dá)水平均升高，而被A71915預(yù)處理后，ANP的上述效應(yīng)可被顯著逆轉(zhuǎn)。本實(shí)驗(yàn)中A71915預(yù)處理后，霧化吸入ANP的A+A組IL-4及GATA-3蛋白表達(dá)量與ANP組相比均降低，提示A71915可能通過(guò)ANP信號(hào)通路調(diào)節(jié)GATA-3及IL-4參與炎癥反應(yīng)。余圓圓等[27]檢測(cè)哮喘患者外周血ANP、IL-4含量及GATA-3的mRNA與蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示檢測(cè)指標(biāo)較正常組均明顯升高，提示ANP信號(hào)與哮喘發(fā)病密切相關(guān)，可能通過(guò)誘導(dǎo)Th2反應(yīng)參與哮喘過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示ANP可以提高Th2細(xì)胞因子IL-4的水平及GATA-3的表達(dá)。

目前，毛細(xì)支氣管炎的治療方式主要為氧療及對(duì)癥治療方式，尚無(wú)有效的RSV疫苗或特異性治療藥物。ANP信號(hào)通路為毛支的治療提供了可能的新途徑，A71915是1992年由Delporte等[28]首次發(fā)現(xiàn)，是NRRA的強(qiáng)大抑制劑，抑制ANP信號(hào)通路后，肺組織中Th2細(xì)胞因子IL-4及特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3表達(dá)均顯著減少，緩解ANP導(dǎo)致的毛細(xì)支氣管炎的Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)化反應(yīng)，有可能成為通過(guò)ANP信號(hào)通路成功治愈毛細(xì)支氣管炎的新思路。