TNFAIP8(TIPE)抑制p53蛋白乙?；龠M宮頸癌增殖機制研究①

姜 杰 周玉明 姜 茹 王美蓉 楊明浩 趙培慶

(濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院檢驗科，煙臺264199)

TIPE(Tumor necrosis factor-α-induced protein 8,TNFAIP8)基因家族是近期發(fā)現(xiàn)的一類新基因家族，與免疫和腫瘤發(fā)生密切相關[1]。該家族包括4個成員：TIPE(TNFAIP8)、 TIPE1(TNFAIP8L1)、TIPE2(TNFAIP8L2)和TIPE3(TNFAIP8L3)[2,3]。TIPE是第一個發(fā)現(xiàn)的TIPE基因家族蛋白，它在轉(zhuǎn)移性頭頸鱗狀細胞癌中高表達，是細胞凋亡的負調(diào)節(jié)分子。隨后發(fā)現(xiàn)其在包括胰腺癌、胃腺癌及子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中高表達，并可促進腫瘤增殖與遷移[4]。但到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)其與宮頸癌的關系及可能的機制。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TIPE2在糖尿病及強直性脊柱炎等炎癥性疾病中表達上調(diào)且與疾病狀態(tài)密切相關[5,6]；TIPE2可促進順鉑誘導的耐藥骨肉瘤細胞凋亡增多，同時發(fā)現(xiàn)TIPE1可促進宮頸癌細胞增殖并抵抗順鉑誘導的細胞凋亡(結(jié)果待發(fā)表)。鑒于TIPE家族與炎癥及腫瘤的高度相關性和成員之間功能不均一性，促使我們驗證TIPE在宮頸癌中的表達及可能的致病機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1抗體及試劑 TIPE免疫組化抗體購自Abcam公司(Ab166804;Abcam,USA),即用型山羊超敏二步法超敏試劑盒購自中杉金橋(PV9003,#K1568220),DAB顯色系統(tǒng)液體DAB酶底物顯色試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司(#DAB-0031/1031)，細胞培養(yǎng)板購自Corning公司(Corning,USA)，WB抗體TIPE、P53及Acetyl-P53(k373)購自Abcam公司(Ab166804,Ab26,Ab62376,respectiv-ely;Abcam,USA)，多功能酶標儀為Thermofisher公司產(chǎn)品(VarioskanFlash,Thermo,USA)，CCK8及細胞周期試劑盒購自上海碧云天生物科技公司(#C0038，#C1052)，TIPE慢病毒干擾載體購自Santa cruz公司(sc-76698,Santa cruz,USA)，人宮頸癌細胞系Siha購自中國科學院上海細胞生物研究所。

1.1.2病例來源 患者來自淄博市中心醫(yī)院及濱州醫(yī)學院煙臺附屬醫(yī)院婦科手術患者且經(jīng)病理確證為宮頸鱗狀細胞癌患者，所有患者皆符合本院倫理委員會制定的倫理學標準，并得到該委員會批準啟動，其中Ⅰ、Ⅱ期患者45例，Ⅲ、Ⅳ期40例。最后根據(jù)患者TIPE表達水平分析生存期并繪制Kaplan-Meier曲線。

1.2方法

1.2.1免疫組化分析 石蠟切片置于60℃烤箱烤片30 min，按操作說明脫蠟及水化；用微波進行抗原修復，然后用Tris-HCl緩沖液進行沖洗，PBS洗3次，每次5 min；3%雙氧水-甲醇對內(nèi)源性過氧化物酶進行封閉10 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加TIPE抗體(1∶80)，置于4℃冰箱過夜；用0.1%Tween-20 PBS洗3次，每次5 min；然后滴加聚合物輔助劑，洗滌后滴加辣根酶標記抗山羊IgG多聚體，室溫孵育15 min；0.1%Tween-20 PBS洗3次，每次5 min；最后進行DAB顯色，蘇木素進行復染，常規(guī)脫水透明，最后用中性樹膠封片。免疫組化結(jié)果按著色強度進行綜合評判，隨機觀察8～10個HPF，結(jié)果取均值。

1.2.2細胞培養(yǎng) Siha細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中(Gibco,Australia)，置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

1.2.3克隆形成實驗 Siha細胞轉(zhuǎn)染干擾慢病毒及對照病毒顆粒后取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)種6孔板(800個/孔)，待細胞形成肉眼可見克隆(細胞數(shù)>50個)后0.1%結(jié)晶紫染色，置光學顯微鏡下觀察并拍照?？寺⌒纬陕实挠嬎惆聪铝泄剑嚎寺⌒纬陕?(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.2.4繪制生長曲線 Siha細胞轉(zhuǎn)染干擾慢病毒及對照病毒顆粒后，取對數(shù)生長期的細胞用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1 000個細胞密度接種到96孔板，每孔體積200 μl。第二天后每孔加CCK8溶液10 μl，繼續(xù)孵育1 h，選擇450 nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.5細胞周期測定 Siha細胞轉(zhuǎn)染干擾慢病毒及對照病毒顆粒后，離心收集細胞并用預冷PBS洗細胞2次。加入預冷70%乙醇，于4℃固定過夜，離心收集細胞，以1 ml的PBS洗細胞一次，加入500 μl PBS含50 μg/ml PI(溴化乙錠)，4℃避光孵育30 min。用BD Aria2流式細胞儀進行檢測，結(jié)果用細胞周期擬和軟件ModFit進行分析。

1.2.6蛋白印跡實驗 細胞轉(zhuǎn)染含TIPE干擾慢病毒載體及空載體對照后，RIPA蛋白裂解液提取兩組細胞總蛋白，酶標儀進行蛋白定量，SDS-PAGE 80 V恒壓電泳，250 I恒流轉(zhuǎn)膜3 h，5%脫脂奶粉封閉 1 h，然后分別與TIPE、p53、p21抗體4℃冰箱孵育過夜(稀釋比例TIPE1 1∶500，p53和p21為 1∶1 000)，TBST洗膜3次，每次5 min鐘后，與二抗室溫作用1 h，ECL法顯影曝光。以GAPDH為內(nèi)參進行比照分析。

1.3統(tǒng)計學分析 采用Graphpad Prism5.0軟件(GraphPad Software,San Diego,CA)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用T檢驗進行分析，單變量分析對數(shù)秩檢驗分析宮頸癌患者生存率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1宮頸癌患者腫瘤組織中TIPE高表達且與生存期負相關 如圖1A、B所示，宮頸癌患者腫瘤組織中較癌旁組織TIPE表達明顯上調(diào)，結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；同時患者按TNM分期分為兩組，A組為Ⅰ、Ⅱ期患者共計45例，B組為Ⅲ、Ⅳ期患者共計40例。分析結(jié)果如圖1C所示，A組TIPE表達量明顯低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，該結(jié)果提示TIPE可能也參與了宮頸癌的轉(zhuǎn)移與侵襲過程。為更進一步探討TIPE在宮頸癌中的意義，我們跟蹤收集了40例宮頸癌患者5年總體生存率數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖1D所示，結(jié)果表明TIPE表達與生存率存在負相關(P<0.05)，該結(jié)果進一步提示高表達的TIPE影響了宮頸癌患者的預后。

圖1 TIPE在宮頸癌組織中高表達且與預后負相關Fig.1 TIPE is highly expressed in cervical cancer tissues and negatively correlated with prognosis

圖2 TIPE促進宮頸癌細胞Siha增殖Fig.2 TIPE promotes Siha cells proliferation

2.2TIPE明顯促進宮頸癌細胞系Siha的增殖能力

結(jié)果如圖2A、2B所示，克隆形成實驗顯示轉(zhuǎn)染TIPE干擾病毒組較空載體組其克隆形成能力顯著下降(P<0.001)，表明TIPE對宮頸癌細胞增殖具有明顯促進作用。同時，采用生長曲線實驗檢測轉(zhuǎn)染TIPE干擾慢病毒后Siha細胞的增殖能力，結(jié)果如圖2C所示，提示其對細胞增殖亦明顯促進，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

2.3TIPE促進Siha細胞S期比值 結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)染TIPE干擾病毒組較正常對照組，細胞周期中S期比值明顯下調(diào)(P<0.01)，G0/G1期及G2/M期則上調(diào)，特別是G0/G1期阻滯明顯，表明TIPE促進宮頸癌細胞的增殖過程。

2.4TIPE抑制p53乙?；捌湎掠畏肿觩21的表達 結(jié)果如圖4所示，TIPE可抑制p53蛋白乙酰化水平，同時轉(zhuǎn)染TIPE干擾病毒后其下游分子p21表達上調(diào)，表明TIPE可能通過抑制p53蛋白乙酰化水平后，從而間接抑制其下游分子p21的表達。

圖3 TIPE明顯增高Siha細胞S期比值Fig.3 TIPE significantly increased the ratio of S phase in Siha cell

圖4 TIPE抑制p53乙?；⒁种破湎掠畏肿觩21的表達Fig.4 TIPE inhibits p53 acetylation and inhibits expression of p21

3 討論

宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，特別是在發(fā)展中國家，其全球癌癥發(fā)病率中高居第4位，是女性癌癥主要死亡原因之一。其每年新發(fā)病例約53萬人，死亡人數(shù)可達27萬[7]。全球約85%的宮頸癌死亡人數(shù)發(fā)生在不發(fā)達國家或發(fā)展中國家，許多欠發(fā)達國家的宮頸癌3～5年生存率不足50%[7]。因此闡明其發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)新型診斷及治療靶點刻不容緩。

TIPE的表達水平與腫瘤的增殖、浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)正相關，例如在食管癌鱗狀細胞癌、胰腺癌、胃腺癌等腫瘤中[8-10]，高表達水平的TIPE可導致細胞過度增殖和細胞遷移增加。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中TIPE表達水平較癌旁組織顯著增高，提示TIPE可能參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。同時TIPE高表達組(++、+++)生存率遠低于低表達組(-、+)，提示TIPE可作為預示宮頸癌預后的分子標志物，并可能在宮頸癌的轉(zhuǎn)移與復發(fā)中發(fā)揮關鍵作用。同時表明TIPE可成為宮頸癌靶向治療的重要靶點，也將成為宮頸癌早期診斷與預后的重要分子。有研究證明，TIPE蛋白由NF-κB活化誘導，是其抗細胞凋亡、促進細胞增殖的分子機制之一[11]。TIPE表達降低可導致血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶1和9(MMP1和MMP9)表達下調(diào)[12]。另外，TIPE可通過Gβγ亞基與Gαi蛋白直接互相作用，參與Gi介導的細胞凋亡抑制[13]。同時，敲除TIPE基因加重葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠結(jié)腸炎模型，可能的機制是TIPE降低了化學品表面上皮細胞的存活[14]。本研究中，發(fā)現(xiàn)TIPE可明顯促進宮頸癌細胞系Siha的增殖能力及增加Siha細胞S期比值，表明TIPE可通過降低G0/G1期阻滯，促進宮頸癌細胞增殖。有研究已經(jīng)提示TIPE可能與p53蛋白互相作用[15]，但沒有確切的及更深入的機制研究，本實驗發(fā)現(xiàn)p53乙酰化水平在轉(zhuǎn)染TIPE干擾慢病毒后升高，且下游分子p21表達上調(diào)，提示TIPE可能通過抑制p53乙?；剑瑥亩鴮е聀21蛋白表達下調(diào)。p21基因亦稱CDKN1A，主要功能為調(diào)控細胞周期捕獲。當細胞暴露于生存壓力下時，p53基因被激活并啟動Cdk抑制劑p21的轉(zhuǎn)錄，p21結(jié)合細胞周期蛋白E1/Cdk2和細胞周期蛋白A2/Cdk2復合物并使其失活，導致pRb低磷酸化和細胞周期停滯于G1期[16,17]。本研究結(jié)果提示TIPE通過抑制p53蛋白活性，從而導致p21表達下調(diào)，進而影響宮頸癌細胞的增殖與細胞周期。

總之，我們的研究結(jié)果表明TIPE可成為宮頸癌靶向治療的重要靶點及早期診斷與預后的重要分子，也提示我們繼續(xù)探討TIPE在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮生物學作用的其他機制。