李文開，鐘禮立，李云，黃寒，梁沫，易紅玲

(湖南省人民醫(yī)院/湖南師范大學附屬第一醫(yī)院，長沙410005)

支氣管哮喘是以氣道慢性炎癥為主要特征的呼吸系統(tǒng)疾病，由多種細胞如中性粒細胞、T淋巴細胞、肥大細胞等炎癥細胞及其合成和分泌的炎癥細胞因子相互作用所致，好發(fā)于兒童[1]。流行病學調(diào)查[2]顯示，兒童支氣管哮喘發(fā)病率為2%～7%。兒童支氣管哮喘急性發(fā)作可導致支氣管炎性細胞浸潤、黏膜充血、分泌物增多等，阻塞患兒氣道，使呼吸阻力增加以及支氣管痙攣，加重患兒喘憋性呼吸困難及缺氧狀態(tài)[3]。早期診斷支氣管哮喘并及時評估病情嚴重程度，對制定針對性治療方案、改善患兒預后有重要意義。有研究[4]認為，炎癥反應、免疫功能異常等與支氣管哮喘發(fā)病密切相關(guān)。去整合素金屬蛋白酶(disintegrins metalloproteinase，ADAM)8屬于解聚素和金屬蛋白酶家族成員，ADAM8與氣道炎癥反應密切相關(guān)[5]。干擾素調(diào)控因子(interferon regulatory factor，IRF)1是核轉(zhuǎn)錄因子，主要介導了細胞免疫過程[6]。關(guān)于ADAM8、IRF1在小兒支氣管哮喘發(fā)病過程中的作用，目前相關(guān)研究相對較少。本研究觀察了支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血ADAM8、IRF1水平變化?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年6月～2018年3月湖南省人民醫(yī)院收治的支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒91例(急性發(fā)作組)。納入標準：滿足2016年中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組修訂的兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[7]中的第1～4條，或者滿足第4、5條。排除標準：①心臟功能不全者；②肝、腎功能障礙者；③納入研究前的1個月內(nèi)接受過糖皮質(zhì)激素或者免疫抑制劑治療者；④有藥物治過敏史者；⑤惡性腫瘤患者。按照“全球哮喘防治倡議”[8]標準將急性發(fā)作組患兒分為輕度組27例(男15例、女12例，年齡3～14歲)、中度組35例(男21例、女14例，年齡4～13歲)、重度組29例(男17例、女12例，年齡3～13歲)。同期隨機選取60例支氣管哮喘緩解期患兒為緩解組(男34例、女26例，年齡4～14歲)，60例健康體檢兒童為對照組(男38例、女22例，年齡3～14歲)。各組性別、年齡有可比性(P均>0.05)。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準，研究對象及家屬知情同意。

1.2 外周血ADAM8、IRF1 mRNA檢測 采用熒光定量PCR法。收集研究對象清晨空腹肘靜脈血4 mL于EDTA抗凝管中，根據(jù)Ficoll-hypaque密度梯度離心法將外周血中單個核細胞分離，置于TRIzol(瑞士Roche公司提供)中，-80 ℃保存?zhèn)錂z。用TRIzol提取外周血單個核細胞中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。ADAM8上游引物序列為5′-GGGAGAAACAACGAAGTTG-3′，下游引物序列為5′-GGTGTGATCAAGCACAGAT-3′，長度為256 bp；IRF1上游引物序列為5′-GCGGCACCTGGCGCACGGCT-5′，下游引物序列為5′-GGTGGAAGCACCAAGAC-3′，長度為128 bp；內(nèi)參照β-actin上游引物序列為5′-GTGACGTGGACAATCCGCAAG-3′，下游的引物序列為5′-GGAAGGTGGACAACGGACGC-3′，長度為25 bp。采用熒光定量PCR法檢測ADAM8、IRF1 mRNA。擴增反應條件：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃持續(xù)20 s，共計40個循環(huán)，每個樣品重復上述操作3次。ADAM8 mRNA及IRF1 mRNA表達水平采用2-ΔΔCt表示。

1.3 ADAM8、IRF1蛋白檢測 采用BCA試劑盒測定外周血單個核細胞中總蛋白，Western blotting法檢測ADAM8、IRF1蛋白，嚴格按照試劑盒說明進行相關(guān)操作。

1.4 肺功能測定 采用耶格肺功能檢測儀檢測各組患兒肺功能指標，包括第1秒用力呼氣量(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1)、用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、用力呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血ADAM8、IRF1 mRNA及蛋白水平比較 急性發(fā)作組中的輕度組、中度組、重度組患兒外周血ADAM8、IRF1 mRNA及蛋白水平高于緩解組和對照組，并且輕度組、中度組、重度組患兒外周血ADAM8 mRNA、IRF1 mRNA及蛋白水平逐漸升高，見表1、2。

2.2 各組肺功能指標比較 急性發(fā)作組中的輕度組、中度組、重度組患兒FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF低于緩解組和對照組，并且輕度組、中度組、重度組患兒外周血FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF逐漸降低，見表3。

表1 各組外周血ADAM8、IRF1 mRNA表達水平比較

注：與緩解組、對照組相比，*P<0.05；與輕度組相比，△P<0.05 ；與中度組相比，#P<0.05。

表2 各組外周血ADAM8、IRF1蛋白相對表達量比較

注：與緩解組、對照組相比，*P<0.05；與輕度組相比，△P<0.05 ；與中度組相比，#P<0.05。

表3 各組肺功能指標比較

注：與緩解組、對照組相比，*P<0.05；與輕度組相比，△P<0.05 ；與中度組相比，#P<0.05。

2.3 急性發(fā)作組患兒外周血ADAM8 mRNA、IFR1 mRNA水平的相關(guān)性及其與肺功能指標的相關(guān)性 急性發(fā)作組患兒外周血ADAM8 mRNA與IFR1 mRNA水平呈正相關(guān)(r=0.793，P<0.05)，ADAM8 mRNA水平與FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF呈負相關(guān)(r分別為-0.659、-0.702，-0.683、-0.761，P<0.05)，IFR1 mRNA與FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF水平呈負相關(guān)(r分別為-0.712、-0.735，-0.728、-0.756，P均<0.05)。

3 討論

目前，臨床主要根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)、肺功能檢查等診斷支氣管哮喘，但不能全面有效評估病情而為臨床用藥提供指導。同時，年齡小于6歲的患兒肺功能檢查的依從性低，以致結(jié)果不穩(wěn)定，準確性相對較低。尋找簡便、高效、重復性好的指標輔助臨床診斷支氣管哮喘，對指導臨床制定針對性治療方案具有重要意義。

研究[9]表明，氣道炎癥與支氣管哮喘發(fā)病密切相關(guān)，多種免疫細胞和炎癥因子介導了其發(fā)生、發(fā)展過程。ADAM是主要在免疫細胞如嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞中表達的分泌型糖蛋白，其主要功能是調(diào)控炎癥細胞遷移以及參與惡性腫瘤的發(fā)病過程[10]。ADAM8屬于ADAM家族成員，具有824個氨基酸殘基膜蛋白，主要表達于細胞的胞質(zhì)及胞膜中。研究[11]顯示ADAM8過度表達參與了肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Knolle等[12]對炎癥小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，ADAM8能誘導炎癥細胞凋亡，清除肺部炎癥細胞，并進一步推斷ADAM8具有抗炎作用。Oreo等[13]發(fā)現(xiàn)嚴重哮喘患者痰液中ADAM8表達上調(diào)，并且與氣道中炎癥細胞的聚集密切相關(guān)，提示ADAM8可使哮喘患者炎癥細胞遷移至氣道。IRF是主要在細胞核中表達的轉(zhuǎn)錄因子，在干擾素信號通路的作用下調(diào)控多種基因的表達，進而參與細胞增殖、分化、細胞免疫等[14]。李茉莉等[15]研究IRF1在大鼠感染呼吸道合胞病毒中的作用，證實了IRF1通過介導大鼠神經(jīng)源性炎癥介質(zhì)表達而參與氣道炎癥的發(fā)生過程。梁雯慧等[16]發(fā)現(xiàn)IRF1表達異常參與調(diào)節(jié)炎癥反應，進而引起哮喘發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血中ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平高于緩解組和對照組，并且急性發(fā)作期患者哮喘病情越嚴重，ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平也高。進一步比較ADAM8、IRF1蛋白在各組中的表達水平，也得到相似結(jié)果。上述結(jié)果說明ADAM8、IRF1高表達可能通過介導氣道炎癥反應而誘導支氣管哮喘的發(fā)作，并促進病情的進展。支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血ADAM8 mRNA與IRF1 mRNA水平呈正相關(guān)，提示兩種標志物通過協(xié)同作用引起氣道炎癥反應，共同介導支氣管哮喘的發(fā)病進程。

支氣管哮喘急性發(fā)作對患兒肺功能造成不同程度的損傷，病情越嚴重則肺功能損傷越嚴重。本研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒肺功能指標FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF低于緩解組和對照組，并且病情越嚴重的患兒其FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF水平越低，提示上述指標能有效評估支氣管哮喘患兒病情嚴重程度。支氣管哮喘急性發(fā)作患兒外周血ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平與其FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF呈不同程度負相關(guān)，說明ADAM8、IRF1異常表達水平越高，患兒炎癥反應越明顯，支氣管哮喘病情進展越快，病情越重，肺功能損傷加重，提示外周血ADAM8、IRF1可作為評估支氣管哮喘病情嚴重程度的重要標志物。

綜上所述，ADAM8、IRF1異常表達介導了小兒支氣管哮喘急性發(fā)作的發(fā)生、發(fā)展過程，并且與肺功能損傷程度有關(guān)，可作為臨床輔助評估小兒支氣管哮喘急性發(fā)作嚴重程度的指標，也可指導臨床用藥。