師志云，陳源昊琪，于辛酉，馬一婧，王青，賈偉

(1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川750001；2寧夏醫(yī)科大學(xué)；3寧夏臨床病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

在育齡期夫婦中，不育癥患者占15%，其中男方因素占50%[1]。在男性不育癥患者中，有50%是由精液異常引起的，其中無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥占0.7%[2]。Y染色體長(zhǎng)臂上的無(wú)精子因子(azoospermia factor，AZF)對(duì)精子的生成起著重要的作用，因其攜帶了精子發(fā)生所需的重要遺傳信息[3]。Y染色體的AZF微缺失是繼Klinefelters綜合征后導(dǎo)致男性不育的第二大原因[4]。卵漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術(shù)已成功應(yīng)用于臨床，使不育癥患者擁有自己的后代成為可能，但Y染色體AZF微缺失可能通過(guò)這種輔助生殖技術(shù)遺傳給后代[5]，所以無(wú)精、少精患者在ICSI治療前應(yīng)篩查Y染色體AZF微缺失。本研究對(duì)200例無(wú)精癥患者進(jìn)行了染色體核型分析及Y染色體AZF基因微缺失觀察?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年1～12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院就診的無(wú)精癥患者200例，年齡23～32歲。按照WHO《人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》進(jìn)行精液分析確診為無(wú)精癥。200例患者均排除器質(zhì)性病變(精索靜脈曲張、附睪疾病、生殖內(nèi)分泌疾病及其他泌尿生殖系統(tǒng)等)、病毒感染，未患過(guò)腮腺炎、睪丸炎、附睪炎，未服用過(guò)對(duì)生殖系統(tǒng)可能造成損傷的藥物。患者對(duì)本研究知情同意。采集患者外周血5 mL，肝素鈉抗凝備用。

1.2 染色體核型分析 取患者外周血進(jìn)行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后，按常規(guī)制備染色體(23對(duì)所有染色體)標(biāo)本，G顯帶鏡檢至少20個(gè)中期分裂相細(xì)胞，分析3～5個(gè)核型。根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2016)對(duì)染色體進(jìn)行染色體核型描述。

1.3 Y染色體AZF基因檢測(cè) ①外周血DNA的提?。翰捎每禐樵噭┕镜难夯蚪M柱式小量提取試劑盒提取人外周血基因組DNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，DeNovix核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定所提取到的DNA含量，-20 ℃保存。②Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區(qū)域6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)的多重PCR凝膠電泳檢測(cè)：受檢Y染色體AZFa區(qū)STS為SY84、SY86，AZFb區(qū)STS為SY127、SY134，AZFc區(qū)STS為SY254、SY255。同時(shí)設(shè)置兩個(gè)內(nèi)對(duì)照基因(男性性別決定基因SRY和編碼鋅指蛋白基因ZFX/ZFY)進(jìn)行擴(kuò)增，并選用正常生育男性、正常女性和雙蒸水分別作陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。核酸電泳PCR產(chǎn)物10 μL，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V,30 min)，觀察DNA電泳條帶。結(jié)果判讀：電泳后目的基因片段顯示擴(kuò)增條帶，質(zhì)控品均在控，該基因位點(diǎn)存在；電泳結(jié)果未見(jiàn)擴(kuò)增基因顯帶，且重復(fù)2次仍無(wú)顯帶，質(zhì)控品均在控，該基因位點(diǎn)缺失。③ Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區(qū)域6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)的熒光定量PCR檢測(cè)：選取上海透景生命科技有限公司AZF檢測(cè)試劑盒，Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區(qū)受檢STS同上，同時(shí)設(shè)置一對(duì)內(nèi)對(duì)照SRY基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)擴(kuò)增曲線直接觀察結(jié)果。結(jié)果判讀：所有標(biāo)本均應(yīng)擴(kuò)增出SRY對(duì)照條帶，若所測(cè)樣品中無(wú)此條帶，提示實(shí)驗(yàn)失?。怀霈F(xiàn)一個(gè)或多個(gè)STS條帶丟失，質(zhì)控品均在控，即可判斷為其對(duì)應(yīng)的STS缺失。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果 200例無(wú)精癥患者中，發(fā)現(xiàn)9例染色體異常(占4.5%)，其中性染色體異常8例[包括4例Y等臂、2例47,XXY、1例inv(Y)、1例染色體多態(tài)Yqh+]、常染色體易位1例。

2.2 Y染色體AZF基因微缺失檢測(cè)結(jié)果 200例無(wú)精癥患者中Y染色體AZF基因微缺失的患者共有18例(總?cè)笔蕿?.0%)。其中AZFb+AZFc區(qū)缺失11例、AZFc區(qū)缺失5例、AZFb區(qū)缺失1例、AZFa區(qū)缺失1例，詳見(jiàn)表1。 多重PCR凝膠電泳和熒光定量PCR兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致。

表1 18例Y染色體AZF基因微缺失情況

2.3 9例染色體異常者的Y染色體AZF基因微缺失情況 200例無(wú)精癥患者中的9例染色體異常者，伴有Y染色體AZF基因微缺失的有6例，詳見(jiàn)表2。

表2 9例染色體異常者的Y染色體AZF基因微缺失情況

3 討論

染色體異常是精子發(fā)生障礙的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，200例無(wú)精癥患者中染色體異常者占4.5%(9/200)，與以往報(bào)道[6,7]的無(wú)精癥患者染色體異常率為2.2%～19.6%相近。染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常會(huì)導(dǎo)致男性出現(xiàn)無(wú)精子、少精子或弱精子的臨床表現(xiàn)，是導(dǎo)致男性不育的重要因素之一。本研究從200例無(wú)精癥患者中檢出性染色體異常8例，包括4例Y等臂，1例克氏綜合征常見(jiàn)的染色體核型47,XXY(即出現(xiàn)兩條以上的X染色體)，表明性染色體異常對(duì)生精功能影響最大，這與文獻(xiàn)[8,9]報(bào)道相符；檢出常染色體異常1例(0.5%)，這個(gè)比例低于文獻(xiàn)[10]報(bào)道的1.1%～7.2%。性染色體異常的8例中染色體多態(tài)1例(0.5%)，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)[11]報(bào)道的12.2%～38%。后期我們需要增大樣本例數(shù)，提高研究結(jié)果的客觀性。

Y染色體微缺失和染色體異常是導(dǎo)致男子無(wú)精子癥和少精子癥的重要遺傳因素[12]。Y染色體AZF基因可劃分為AZFa、AZFb、AZFc3個(gè)不同區(qū)域，AZFa區(qū)缺失可導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征(sertoli cell only syndrome，SCOS)，臨床表現(xiàn)為無(wú)精子癥[13]；AZFb和AZFb+AZFc整段缺失的患者典型睪丸組織學(xué)特征為SCOS或生精阻滯；AZFc缺失患者殘存了精子生成能力，多見(jiàn)于無(wú)精子癥或者嚴(yán)重少精子癥患者[14]。國(guó)內(nèi)外不同實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的AZF基因總微缺失率跨度很大，為1%～55%[15]。本研究對(duì)200例無(wú)精癥患者進(jìn)行AZF基因微缺失檢查，總體缺失率為9.0%，位于上述范圍但相對(duì)偏低，可能由于各實(shí)驗(yàn)室選擇對(duì)象來(lái)自的地域不同有關(guān)，不排除其缺失率存在地域差異的可能。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)精癥患者Y染色體AZF基因的AZFb+AZFc區(qū)域缺失最常見(jiàn)，其次為AZFc區(qū)域缺失，AZFa區(qū)域和AZFb區(qū)域缺失最少見(jiàn)，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的亞洲西南地區(qū)無(wú)精癥患者Y染色體微缺失率10%、缺失位點(diǎn)多數(shù)在AZFc區(qū)大致相同。

多重PCR凝膠電泳技術(shù)是我國(guó)Y染色體微缺失分子診斷指南(草案)推薦使用的方法，此方法可檢測(cè)STS較多，價(jià)格較實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)便宜，但此方法有較多局限性，比如操作自動(dòng)化不高，在檢測(cè)大批量樣本時(shí)十分耗時(shí)耗力，而且在電泳時(shí)需加入溴化乙錠，操作時(shí)容易污染實(shí)驗(yàn)室。而熒光定量PCR檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，通過(guò)擴(kuò)增曲線直接觀察結(jié)果，無(wú)需PCR后進(jìn)行凝膠電泳，該方法比多重PCR凝膠電泳技術(shù)節(jié)約大量時(shí)間，減少工作量，提高臨床檢驗(yàn)工作效率。本研究結(jié)果顯示，多重PCR凝膠電泳技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)對(duì)200例無(wú)精癥患者AZF基因的6個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果完全一致。

綜上所述，無(wú)精癥患者染色體核型異常及Y染色體AZF基因微缺失多見(jiàn)，可能是男性不育的重要原因。對(duì)于男性不育患者，檢測(cè)Y染色體AZF基因的微缺失是必要的，可明確無(wú)精子、少精子癥的發(fā)病原因，為患者接受輔助生殖治療和遺傳咨詢提供幫助。本研究分別采用多重PCR電泳技術(shù)與熒光定量PCR技術(shù)對(duì)無(wú)精癥患者的Y染色體AZF基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果一致，熒光定量PCR技術(shù)更省時(shí)省力，因此適用于Y染色體AZF基因微缺失的篩查。