李虎， 戴仁懷

(1. 陜西理工大學(xué)，陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西漢中723000； 2.貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)550025)

廣頭葉蟬亞科Macropsinae隸屬于半翅目Hemiptera頭喙亞目Auchenorrhyncha角蟬總科Membracoidea葉蟬科Cicadellidae，廣泛分布于世界各地。目前全世界已報(bào)道該亞科約19屬750余種，我國(guó)記錄7屬108種。廣頭葉蟬大多取食木本植物，為重要的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)林木害蟲。目前已知的寄主主要有薔薇科Rosaceae、胡頹子科Elaeagnaceae、榆科Ulmaceae、殼斗科Fagaceae、小檗科Berberidaceae(Tishechkin，1994，1999，2002)、楊柳科Salicaceae和樺木科Betulaceae等植物(Lietal.，2012，2013，2014)；也有報(bào)道廣頭葉蟬取食桑科Moraceae植物(魏重生，蔡平，1998)。

廣頭葉蟬亞科分類系統(tǒng)較混亂，部分族屬級(jí)分類地位一直存在爭(zhēng)議。Evans(1937)最先提出廣頭葉蟬科Macropsidae概念，隨后又降為亞科(Evans，1946)，包含Macropsini和Nioniini兩族；Linnavuori(1978)將Nioniini提升為亞科Nioniinae，同時(shí)將其中的Neopsis屬提升為亞科級(jí)Neopsinae，但Hamilton(1983)仍以族級(jí)水平對(duì)待；Dietrich(2005)根據(jù)形態(tài)特征恢復(fù)Neopsinae。在屬級(jí)水平上，橫皺葉蟬屬Oncopsis和斜皺葉蟬屬Pediopsis初為Bythoscopus的亞屬，后分別被提升為屬，但包括廣頭葉蟬屬M(fèi)acopsis、暗紋葉蟬屬Pediopsoides、Galboa、Stenoscopus在內(nèi)早期均屬于短頭葉蟬科Bythoscopidae，后被移入廣頭葉蟬亞科(Evans，1937)。Hamilton(1980)依據(jù)外形及雄蟲外生殖器特征將古北區(qū)特有屬M(fèi)acropsidius降為亞屬，但Tishetshkin(2006，2007，2014)、Yang和Zhang(2015)均以屬級(jí)水平對(duì)待；在Hamilton(1980)的分類系統(tǒng)中，將Parasitades、Nanopsis、Kiamoncopsis也降為亞屬，但也存在爭(zhēng)議。

為了進(jìn)一步掌握廣頭葉蟬亞科屬種間的分子差異程度和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本文選擇昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究中常用的線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)為標(biāo)記基因，對(duì)中國(guó)常見(jiàn)的廣頭葉蟬亞科5屬22種進(jìn)行COⅠ基因序列擴(kuò)增，研究目標(biāo)序列的序列組成和遺傳距離特征，并構(gòu)建中國(guó)廣頭葉蟬亞科系統(tǒng)發(fā)育框架，研究結(jié)果可為整個(gè)亞科的系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建及物種的快速鑒定提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取中國(guó)廣頭葉蟬亞科5屬22種和片角葉蟬亞科Idiocerinae 1種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。樣本主要來(lái)源于無(wú)水乙醇浸泡標(biāo)本和針插保存的干燥標(biāo)本，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取使用ddH2O清洗樣本，去ddH2O后加入STE緩沖液(樸美花等，2002)浸泡過(guò)夜，棄去STE緩沖液，用沖洗緩沖液清洗2～3次，吸水紙吸去樣本殘余液體、晾干。然后取蟲體頭胸部研磨碎，使用血液/細(xì)胞/組織基因DNA提取試劑盒[tgDP304-02，天根生化科技(北京)有限公司]提取總DNA測(cè)定濃度后調(diào)整為1～2 ng·L-1保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)體系使用通用引物(Folmeretal.，1994)進(jìn)行COⅠ基因序列片段的PCR擴(kuò)增：上游引物L(fēng)CO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；下游引物HCO2198：5’-TAAAC-TTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。PCR反應(yīng)體系參考PCR試劑盒Taq PCR Master Mix，選用30 μL反應(yīng)體系，針對(duì)無(wú)水乙醇浸泡標(biāo)本和針插干標(biāo)本進(jìn)行一定的調(diào)整，模板DNA、上下游引物(10 μM)、Mix、ddH2O分別為：1 μL、2 μL、15 μL、12 μL(無(wú)水乙醇浸泡標(biāo)本)；4 μL、2 μL、15 μL、9 μL(針插干標(biāo)本)。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，40～43 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃總延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物原液送北京華大基因組測(cè)序部進(jìn)行常規(guī)純化雙向測(cè)序。

1.2.3DNA數(shù)據(jù)處理與分析使用SeqMan對(duì)所得序列進(jìn)行拼接和編輯，使用MEGA 6.06、Clustal W進(jìn)行序列比對(duì)。序列組成分析和遺傳距離的計(jì)算使用MEGA 6.06，系統(tǒng)發(fā)育建樹使用MrBayes 3.2和PAUP*4.0。

1.2.4遺傳距離計(jì)算遺傳距離的計(jì)算基于MEGA 6.06的K2參數(shù)模型。利用Excel的數(shù)據(jù)分析功能統(tǒng)計(jì)平均值(Means)和標(biāo)準(zhǔn)差(SE)，使用SPSS 22.0基于最小顯著差異法(LSD)對(duì)遺傳距離進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.5系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建選用最優(yōu)模型GTR+I+G(參數(shù)：-lnL=5 421.611 8，K=10，AIC=10 863.223 6)，使用PAUP*4.0 [參數(shù)：Lset Base=(0.340 3，0.166 2，0.109 6)，Nst=6，Rmat=(0.883 4，6.885 8，2.787 8，0.547 6，17.361 7)，Rates=gamma，Shape=0.814 6，Pinvar=0.416 0]，最大似然(ML)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用MrBayes 3.2[參數(shù)：lset nst=6，rates=gamma，prset statefreqpr=fixed (0.340 3，0.166 2，0.109 6，0.383 8)，shapepr=fixed(0.8146)，pinvarpr=fixed(0.416 0)；prset revmatpr=fixed (0.883 4，6.885 8，2.787 8，0.547 6，17.361 7，1.000 0)]，貝葉斯(BI)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 廣頭葉蟬亞科系統(tǒng)發(fā)育分析選擇的代表種Table 1 Representative species used for phylogeny analysis of Macropsinae

2 結(jié)果

2.1 序列組成

序列拼接和比對(duì)刪除兩端參差不齊的堿基序列后為642 bp，序列組成分析結(jié)果見(jiàn)表2。內(nèi)群數(shù)據(jù)組各成分與含外群數(shù)據(jù)組之間除簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有所下降、自裔位點(diǎn)輕微上升外沒(méi)有明顯的差異。23條序列中，保守位點(diǎn)304個(gè)，變異位點(diǎn)338個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)289個(gè)，自裔位點(diǎn)49個(gè)，T、C、A、G含量分別為35.7%、17.4%、32.6%和14.3%，A+T含量為68.3%，明顯高于G+C含量(31.7%)。

表2 COⅠ基因序列數(shù)據(jù)組的序列組成統(tǒng)計(jì)值Table 2 Statistics of nucleotide composition of each data set for COⅠ gene sequences

2.2 遺傳距離

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，COⅠ基因序列片段在種間、屬間和亞科間的遺傳距離的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 COⅠ基因序列數(shù)據(jù)組不同階元間P距離的差異統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of P-distance of each data set for COⅠ gene sequences in different taxa

注： 不同字母表示兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD：P<0.05)

Notes： different letters indicate there is a significant difference (LSD：P<0.05)

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

ML樹(圖1：左)和BI樹(圖1：右)的聚類結(jié)果基本一致，僅針突尖尾葉蟬Pedionisacerosa和齒緣尖尾葉蟬P.aculeata的聚類稍有差異。最先分出廣頭葉蟬屬的4種，有較高的置信度；隨后斜皺葉蟬屬種類Pediopsissp.分出；接著南昆山尖尾葉蟬Pedionisnankunshanensis與廣頭葉蟬屬的2種聚在一起；暗紋葉蟬屬2種與尖尾葉蟬屬Pedionis4種聚成一大支；橫皺葉蟬屬4種聚在一起形成一支，并與尖尾葉蟬屬、廣頭葉蟬屬和暗紋葉蟬屬剩余種聚合在一起。

圖1 基于COⅠ基因最大似然法(左)和貝葉斯法(右)構(gòu)建的廣頭葉蟬亞科系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogeny trees based on COⅠ gene sequences for Macropsinae using Maximum Likelihood (left) and Bayesian Inference (right)

3 討論

本文獲得了廣頭葉蟬亞科22種和片角葉蟬亞科1種共23條COⅠ基因的部分片段序列，其中，保守位點(diǎn)304個(gè)，變異位點(diǎn)338個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)289個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)占總位點(diǎn)數(shù)的45.0%，能夠較好地提供系統(tǒng)發(fā)育所需信息；T、C、A、G含量分別為35.7%、17.4%、32.6%、14.3%，AT偏倚明顯。不同種類間的遺傳距離平均值約為0.10，而不同階元間(種-屬-亞科)遺傳距離差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ML樹和BI樹較好地反映了中國(guó)廣頭葉蟬亞科屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，支持了橫皺葉蟬屬和尖尾葉蟬屬的單系性，但廣頭葉蟬屬和暗紋葉蟬屬較為混亂。

3.1 COⅠ基因在廣頭葉蟬亞科物種鑒定中的應(yīng)用

廣頭葉蟬亞科22種的種間遺傳距離大于Hebert等(2003a，2003b)推薦的區(qū)分物種的最小種間遺傳距離(0.02)，一定程度上說(shuō)明了基于COⅠ基因的DNA條形碼對(duì)于鑒定廣頭葉蟬亞科種類是比較適用的。本文提供了22種廣頭葉蟬的DNA條形碼序列，為廣頭葉蟬亞科的分子鑒定提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.2 廣頭葉蟬亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

廣頭葉蟬屬是廣頭葉蟬亞科中物種數(shù)最多的類群，其形態(tài)特別是外生殖器特征高度相似(Lietal.，2012，2013，2014)，所以從形態(tài)學(xué)上看，廣頭葉蟬屬的分類毋庸置疑，但從系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果來(lái)看，該屬物種并未全部聚合成一支，其原因可能是存在趨同進(jìn)化。鈍圓尖尾葉蟬Pedionisobtusata與橫皺葉蟬屬聚合支構(gòu)成姊妹關(guān)系，對(duì)比其形態(tài)學(xué)特征發(fā)現(xiàn)，鈍圓尖尾葉蟬的陽(yáng)莖、連索等特征完全符合尖尾葉蟬屬特點(diǎn)，說(shuō)明尖尾葉蟬屬與橫皺葉蟬屬有較近的親緣關(guān)系。尖尾葉蟬屬除鈍圓尖尾葉蟬和南昆山尖尾葉蟬外，都能聚在一起，基本支持其單系性；鈍圓尖尾葉蟬如前所述，與橫皺葉蟬屬關(guān)系較近，而南昆山尖尾葉蟬和瘤突廣頭葉蟬Macropsistuberculiformis聚為一支，其原因尚需進(jìn)一步研究。暗紋葉蟬屬最為混亂，而該屬也是目前廣頭葉蟬中最有爭(zhēng)議的一個(gè)屬，其分類地位可能存在問(wèn)題；依Hamilton(1980)的系統(tǒng)，該屬包含5個(gè)亞屬，作者與俄羅斯學(xué)者Tishechkin博士(Department of Entomology，F(xiàn)aculty of Biology，M.V. Lomonosov Moscow State University，Vorobyevy Gory，Moscow，Russia)和日本學(xué)者Okudera博士(Entomological Laboratory，F(xiàn)aculty of Agriculture，Kyushu University，F(xiàn)ukuoka，Japan)交流，均表示該屬目前存在一些問(wèn)題，但由于標(biāo)本掌握不全，有些亞屬僅分布在新北區(qū)，有些僅分布在非洲區(qū)，加之該屬的形態(tài)特征高度近似，且存在交叉，因而無(wú)法提出合適的修訂意見(jiàn)；該屬的演化關(guān)系需在補(bǔ)充標(biāo)本后進(jìn)一步研究。

本文為廣頭葉蟬亞科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供了重要的基礎(chǔ)信息。昆蟲線粒體COⅠ基因被廣泛用于物種鑒定，因其序列片段較短，能夠提供用于系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建的信息可能并不完整。本文中廣頭葉蟬屬、尖尾葉蟬屬和暗紋葉蟬屬的單系性并不理想，這樣的結(jié)果或許并不是分類本身的原因，也可能是由于當(dāng)前的數(shù)據(jù)不足以支撐其構(gòu)成單系，后續(xù)可獲取多基因的序列數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)一步探討和完善中國(guó)廣頭葉蟬亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。