呂梁玉,羅華彬,呂鳴春,楊文鴿,張進(jìn)杰,樓喬明,徐大倫,傅 佳*
(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 寧波 315211)
食品輻照是一種新興的食品加工技術(shù),因其安全高效的特性而廣泛應(yīng)用于食品保鮮及品質(zhì)改善[1-3]。研究表明,輻照對(duì)肉類食品進(jìn)行殺菌的同時(shí),會(huì)引起維持肌肉蛋白構(gòu)象的化學(xué)作用力如氫鍵、二硫鍵、離子鍵、疏水力等發(fā)生變化,導(dǎo)致肌肉蛋白變性、聚集或凝膠化等,從而影響肉制品的品質(zhì)。
魚類經(jīng)采肉、斬拌、擂潰、加熱等工藝加工而成的具有彈性的凝膠即為魚糜凝膠,凝膠的形成與魚糜蛋白化學(xué)作用力的變化有關(guān),而魚糜凝膠性能、流變特性等均為評(píng)價(jià)魚糜品質(zhì)的重要指標(biāo)。劉海梅等[4]研究了鰱魚魚糜凝膠形成過程,認(rèn)為疏水作用力、二硫鍵等是維持鰱魚魚糜凝膠穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)作用力,Lin Xianping等[5]以不同劑量電子束輻照帶魚魚糜,得出類似結(jié)論。通過樣品應(yīng)力變化所得到的質(zhì)構(gòu)和流變性指標(biāo)能反映肌肉蛋白的結(jié)構(gòu)及其凝膠形成,Wang He等[6]采用0、1、3、6、9 kGy的60Co-γ射線輻照南美白對(duì)蝦,并未發(fā)現(xiàn)輻照對(duì)樣品的咀嚼度、彈性有顯著影響。有關(guān)化學(xué)作用力、流變特性與魚糜凝膠性能的相關(guān)研究不乏報(bào)道,如李立杰等[7]通過建立Burgers模型,研究了真空微凍狀態(tài)下南美白對(duì)蝦蝦肉流變學(xué)特性的變化,認(rèn)為貯藏后期蝦肉黏性和彈性模量的明顯下降與其肌肉組織狀態(tài)及品質(zhì)變化有關(guān);Jaczynski等[8]以不同劑量電子束輻照狹鱈魚糜,發(fā)現(xiàn)低劑量(≤6 kGy)輻照組魚糜凝膠剪切力隨著輻照劑量的增加而增加。但電子束輻照對(duì)魚糜蛋白的影響研究較少,尤其是電子束輻照對(duì)梅魚魚糜流變學(xué)特性及其化學(xué)作用力的影響鮮見報(bào)道。
本實(shí)驗(yàn)以利用海水經(jīng)濟(jì)魚類梅魚加工而成的魚糜為原料,研究不同電子束輻照劑量(0~9 kGy)對(duì)魚糜流變特性、化學(xué)作用力及其凝膠特性的影響,確定合適的電子束輻照前處理魚糜劑量,旨在為輻照技術(shù)在魚糜加工中的應(yīng)用提供參考。
冷凍梅魚魚糜 浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司;食鹽寧波市鹽業(yè)有限公司;聚偏二氯乙烯腸衣(食品級(jí))南通皇佳腸衣有限公司。
牛血清白蛋白、β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R-250、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、過硫酸銨、甘氨酸(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷(tri-hydroxymethyl aminomethane,Tris)、Tris-馬來酸(分析純)美國S i g m a公司;福林-酚試劑、乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetramethylethylenediamine,TEMED)、廣譜蛋白彩虹maker(分析純,11~245 kDa) 北京索萊寶科技有限公司。
XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司;ML104/02型電子天平 梅特勒-托利儀器(上海)有限公司;Biofuge Stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Thermo Scientific Sorvall公司;Spectra Max i3多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;EPS-300穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 上海天能科技有限公司;TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司;NBL1020電子直線加速器(能量10 MeV) 寧波超能科技股份有限公司;UMC 5真空斬拌機(jī) 德國Stephan Machinery公司;AR2000ex流變儀 美國TA儀器公司。
1.3.1 魚糜輻照處理
參考Lin Xianping等[9]的方法,梅魚魚糜300 g/袋真空包裝,利用電子直線加速器輻照,劑量分別為0、1、3、5、7、9 kGy,其中0 kGy為對(duì)照組,輻照劑量誤差小于3%。每組劑量設(shè)3 個(gè)平行;為保證輻照均勻,輻照時(shí)各樣品整齊排列,防止疊壓造成平行樣之間的差異。
1.3.2 魚糜凝膠制備
取冷凍梅魚魚糜,冰箱冷藏室(4 ℃)解凍后置于真空斬拌機(jī)中低溫空斬2 min,添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%食鹽繼續(xù)斬拌8 min。將斬拌后的魚糜溶膠灌入直徑25 mm、長約10 cm的腸衣,腸衣兩頭扎緊,再進(jìn)行二段式加熱凝膠化(40 ℃加熱60 min后,90 ℃高溫凝膠化30 min),冷卻得到魚糜凝膠,4 ℃貯藏備用,保存時(shí)間不超過一周。
1.3.3 持水性測(cè)定
參照Sánchez-González等[10]的方法,將各組魚糜凝膠切成2 mm厚薄片,用濾紙包好裝入離心管底部,3 000 r/min離心10 min。記離心管質(zhì)量為m,離心前后離心管與樣品總質(zhì)量分別為m1和m2。持水性按公式(1)計(jì)算。
1.3.4 白度測(cè)定
利用色差儀測(cè)定各組魚糜凝膠色差,分析前用標(biāo)準(zhǔn)白板校正色差儀。白度按公式(2)計(jì)算。
式中:L*、a*、b*分別為魚糜凝膠的亮度值、紅綠值、黃藍(lán)值。
1.3.5 質(zhì)構(gòu)指標(biāo)測(cè)定
利用質(zhì)構(gòu)分析儀測(cè)定各組魚糜凝膠的全質(zhì)構(gòu)指標(biāo)。樣品厚度約20 mm,測(cè)定參數(shù):TPA模式,探頭型號(hào)P50,測(cè)前速率1.0 mm/s,測(cè)試速率1.0 mm/s,測(cè)后速率1.0 mm/s,壓縮比50%,觸發(fā)值10 g,數(shù)據(jù)采集速率400 pps。
1.3.6 魚糜及魚糜凝膠化學(xué)作用力分析
參考Gómez-Guillen[11]、Careche[12]等的方法。配制A、B、C、D、E 5 種溶液,其中A為0.05 mol/L NaCl,B為0.6 mol/L NaCl,C為0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素,D為0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素,E為0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.05 mol/L β-巰基乙醇。實(shí)驗(yàn)分為5 組,每組取魚糜或魚糜凝膠2 g,分別加入10 mL的A、B、C、D、E溶液,混勻,4 ℃靜置1 h,10 000 r/min離心15 min,福林-酚法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)量濃度。計(jì)算時(shí),離子鍵、氫鍵、疏水作用力和二硫鍵的貢獻(xiàn)分別以溶解于B溶液與A溶液中蛋白質(zhì)量濃度之差、溶解于C溶液與B溶液中蛋白質(zhì)量濃度之差、溶解于D溶液與C溶液中蛋白質(zhì)量濃度之差、溶解于E溶液與D溶液中蛋白質(zhì)量濃度之差表示。
1.3.7 魚糜肌原纖維蛋白組成分析
參考Xiong Guangquan等[13]的方法略作修改。2 g魚糜加20 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液20 mL(pH 7.0,含0.05 mol/L KCl),充分勻漿后10 000 r/min離心15 min,沉淀加入20 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液20 mL(pH 7.0,含0.6 mol/L KCl),充分勻漿,靜置提取1 h后10 000 r/min離心15 min,上清液即為魚糜肌原纖維蛋白溶液。采用福林-酚法測(cè)定肌原纖維蛋白含量。
參照Laemmli[14]的方法進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)實(shí)驗(yàn)。肌原纖維蛋白溶稀釋至1 mg/mL,分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,膠厚1 mm;樣品上樣量為10 μL,標(biāo)準(zhǔn)物上樣量為5 μL,起始電壓為80 V,進(jìn)入分離膠后電壓改為100 V??捡R斯亮藍(lán)R-250染色,凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。
1.3.8 魚糜流變學(xué)指標(biāo)測(cè)定
參考Delgado-Pando等[15]的方法稍作修改。解凍后魚糜空斬2 min,調(diào)節(jié)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)至80%。采用40 mm直徑平板夾具,平行板間距為1 mm。上樣量約為3 mL,石蠟密封防止水分蒸發(fā),刮板刮去多余樣品,分別進(jìn)行頻率掃描和溫度掃描。頻率掃描條件:振蕩模式,頻率范圍為0.1~10 Hz(1 Hz=2π rad/s),溫度為20 ℃。溫度掃描條件:從20 ℃以2 ℃/min速率升溫至90 ℃,保持溫度2 min后以5 ℃/min速率降至20 ℃,振蕩頻率為1 Hz。
實(shí)驗(yàn)設(shè)置3~6 個(gè)平行,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,Origin 9.0軟件作圖、SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù),并進(jìn)行單因素方差分析,Duncan多重比較檢驗(yàn)顯著性,P<0.05表示差異顯著。
2.1.1 梅魚魚糜凝膠的持水性與白度
圖 1 輻照劑量對(duì)梅魚魚糜凝膠持水性和白度的影響Fig. 1 Effect of irradiation on water-holding capacity and whiteness of C. lucidus surimi gels
由圖1可知,持水性和白度都是評(píng)價(jià)魚糜凝膠品質(zhì)的重要指標(biāo)。魚糜凝膠的持水性主要與其凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)[16],電子束輻照會(huì)影響魚糜凝膠結(jié)構(gòu),引起凝膠網(wǎng)絡(luò)中的水分子重新排布,有可能使其凝膠的持水性增高。良好的凝膠色澤有助于提高消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的接受度,魚糜凝膠白度與魚糜蛋白變形程度與肌球蛋白的變性程度呈正相關(guān)[17],同時(shí)與魚糜凝膠的持水性有關(guān),持水性較好的魚糜凝膠往往具有較好的色澤和透明度。
隨著輻照劑量的增加,梅魚魚糜凝膠的持水性和白度總體都呈先上升后下降的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,1 kGy處理組魚糜凝膠的持水性并無顯著變化,3~7 kGy處理組有顯著上升(P<0.05),并在5 kGy處理組達(dá)到最大值,9 kGy處理組又降低,可能是由于小劑量輻照不足以引起水分子重新排布,而劑量過高又會(huì)破壞魚糜凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),引起持水性下降。Riebroy等[18]發(fā)現(xiàn)6 kGy60Co-γ輻照會(huì)引起大眼鯛魚肉制品持水性的下降,認(rèn)為持水性的改變與蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)。由圖1可見,輻照劑量大于3 kGy時(shí),梅魚魚糜凝膠白度顯著上升(P<0.05),在5 kGy時(shí)達(dá)到最大值。Park[19]研究表明,白度與持水性有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性,持水性增加,白度也隨之增大,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此類似。針對(duì)提高梅魚魚糜凝膠持水性和白度,5 kGy和7 kGy都是較適的輻照劑量。
2.1.2 梅魚魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)特性
由圖2可以看出,隨著輻照劑量的增加,魚糜凝膠硬度、彈性、黏聚性和咀嚼性均呈先上升后下降的趨勢(shì)。5 kGy處理組魚糜凝膠硬度、咀嚼性、黏聚性均達(dá)到最大值,而彈性最大值出現(xiàn)在7 kGy處理組。這與根據(jù)持水性和白度的變化所選擇的輻照劑量一致。
硬度、咀嚼性、黏聚性、彈性等質(zhì)構(gòu)特性表征了肌肉蛋白凝膠的力學(xué)性能,借助這些指標(biāo)可直觀地了解凝膠狀態(tài),推測(cè)凝膠結(jié)構(gòu)及其各組分的凝膠形成作用力[20-21],是評(píng)價(jià)魚糜凝膠品質(zhì)的重要指標(biāo)。Jaczynski等[22]利用0、1、2、4 kGy劑量電子束輻照冷凍魚糜制品,發(fā)現(xiàn)輻照后魚糜制品硬度有顯著提高,推測(cè)可能是輻照導(dǎo)致魚糜蛋白之間的相互作用增強(qiáng)而引起。
圖 2 輻照劑量對(duì)梅魚魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig. 2 Effect of irradiation on textural properties of C. lucidus surimi gels
氫鍵、二硫鍵、離子鍵、疏水作用力等化學(xué)作用力與蛋白質(zhì)的構(gòu)象及魚糜凝膠結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。隨著輻照劑量的增加,梅魚魚糜和魚糜凝膠的化學(xué)作用力發(fā)生變化,結(jié)果見圖3、4。魚糜中離子鍵和氫鍵的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于魚糜凝膠,而疏水作用力和二硫鍵則相反。隨著輻照劑量的增加,魚糜、魚糜凝膠中的離子鍵和氫鍵的貢獻(xiàn)變化趨勢(shì)基本一致,都是先減小后增加;在魚糜中,5 kGy處理組離子鍵的貢獻(xiàn)顯著低于其他組(P<0.05),5 kGy和7 kGy處理組氫鍵的貢獻(xiàn)沒有顯著差異(P>0.05),但均顯著低于其余組(P<0.05)。各組魚糜和魚糜凝膠中二硫鍵的貢獻(xiàn)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),隨輻照劑量增加,疏水作用力先增加后減小,并均在5 kGy處達(dá)到峰值。
圖 3 輻照劑量對(duì)梅魚魚糜化學(xué)作用力的影響Fig. 3 Effect of irradiation on chemical interactions of C. lucidus surimi
Deng Siyao等[23]對(duì)輻照梅魚魚糜拉曼光譜進(jìn)行分析,認(rèn)為輻照有助于熱誘導(dǎo)凝膠化過程中魚糜蛋白二硫鍵的形成,可有效提高凝膠強(qiáng)度;Jaczynski等[8]研究了電子束輻照劑量對(duì)狹鱈魚糜蛋白結(jié)構(gòu)及其凝膠特性的影響,發(fā)現(xiàn)魚糜蛋白的疏水性及二硫鍵形成量隨著劑量的增加而增加,超過最適劑量6 kGy后又開始下降。通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,認(rèn)為在梅魚魚糜熱誘導(dǎo)凝膠過程中,魚糜蛋白疏水力和二硫鍵是穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)作用力,Gómez-Guillen[11]、李杰[24]等研究亦有類似結(jié)論;相對(duì)其他輻照劑量,5 kGy的電子束輻照更有利于增加梅魚魚糜和魚糜凝膠中的二硫鍵和疏水作用力,從而促進(jìn)魚糜凝膠的形成。
圖 4 輻照劑量對(duì)梅魚魚糜凝膠化學(xué)作用力的影響Fig. 4 Effect of irradiation on chemical interactions of C. lucidus surimi gels
圖 5 梅魚魚糜肌原纖維蛋白SDS-PAGE譜圖Fig. 5 SDS-PAGE pattern of myof i brillar proteins from C. lucidus surimi
如圖5所示,分子質(zhì)量220 kDa左右條帶為肌球蛋白重鏈,48 kDa左右的條帶為肌動(dòng)蛋白。經(jīng)高劑量(≥7 kGy)電子束輻照之后,梅魚魚糜肌原纖維蛋白條帶發(fā)生了變化,表現(xiàn)為肌球蛋白重鏈降解,但降解并不明顯;肌動(dòng)蛋白條帶無明顯變化。說明輻照對(duì)梅魚魚糜肌原纖維蛋白的降解作用并不顯著,對(duì)梅魚魚糜凝膠的形成不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面作用。
電子束輻照引起梅魚魚糜蛋白一定程度的變性,對(duì)魚糜凝膠的持水性、白度和質(zhì)構(gòu)特性有顯著的影響。綜合輻照劑量對(duì)梅魚魚糜凝膠特性的影響及能源節(jié)省的考慮,認(rèn)為5 kGy電子束輻照處理梅魚魚糜顯著改善了梅魚魚糜品質(zhì),可作為合適的輻照劑量應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。后續(xù)僅比較5 kGy處理組與對(duì)照組(0 kGy)梅魚魚糜的流變學(xué)特性。
2.4.1 頻率對(duì)梅魚魚糜儲(chǔ)能模量及損耗角正切的影響
在流變學(xué)中,儲(chǔ)能模量(G’)也稱彈性模量,反映蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成情況,是樣品的彈性特征;與之相對(duì)應(yīng)的耗能模量(G”)也稱黏性模量,是樣品的黏性特征。一般用損耗角正切tan δ,即G”與G’的比值來表征體系的黏彈性[25];tan δ小于1表明體系趨于固體特性,彈性成分占優(yōu)勢(shì);tan δ大于1表明體系趨于流體特性,黏性成分占優(yōu)勢(shì)。
圖 6 角度頻率對(duì)梅魚魚糜儲(chǔ)能模量及損耗角正切的影響Fig. 6 Effect of frequency on storage modulus and tan δ of C. lucidus surimi
如圖6所示,隨著角度頻率的增加,G’呈上升趨勢(shì),在頻率小于2π rad/s(1 Hz)時(shí)增幅明顯,大于2π rad/s時(shí)趨勢(shì)平緩,而tan δ在頻率小于2π rad/s時(shí)逐步減小,大于2π rad/s時(shí)緩慢增加,可能是由于魚糜蛋白形成的凝膠結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)固,較小的頻率并不能破壞其凝膠結(jié)構(gòu),反而有助于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成,頻率過高則會(huì)破壞其三維結(jié)構(gòu),體系向黏性方向轉(zhuǎn)變。5 kGy輻照后G’總是高于對(duì)照組(P<0.05),tan δ總是小于對(duì)照組(P<0.05),說明5 kGy輻照對(duì)梅魚魚糜凝膠彈性有一定的提升,這與之前質(zhì)構(gòu)特性的結(jié)果相一致。
2.4.2 溫度對(duì)梅魚魚糜儲(chǔ)能模量的影響
圖 7 升溫過程梅魚魚糜儲(chǔ)能模量的變化Fig. 7 Effect of temperature on storage modulus of C. lucidus surimi during heating process
圖 8 降溫過程梅魚魚糜儲(chǔ)能模量的變化Fig. 8 Effect of temperature on storage modulus of C. lucidus surimi during cooling process
如圖7、8所示,在升溫過程中,G’的變化大致分為3 個(gè)階段。第一階段為20~31 ℃,此階段G’隨溫度的升高而升高,推測(cè)可能是由于魚糜蛋白在低溫下開始交聯(lián),并初步形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。第二階段31~43 ℃,此階段G’隨溫度的升高而減小,一方面可能是肌球蛋白開始解螺旋,破壞了蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu);另一方面可能是由于魚糜內(nèi)源蛋白酶的作用,影響了凝膠結(jié)構(gòu)的形成。第三階段43~90 ℃,G’隨溫度的升高迅速增大,這是蛋白質(zhì)分子迅速展開,凝膠結(jié)構(gòu)充分形成所引起[26]。
Xia Xiufang[27]、Chen Hongsheng[28]等研究發(fā)現(xiàn),草魚肌原纖維蛋白在升溫過程中可分為20~55 ℃、55~63 ℃、63~85 ℃ 3 個(gè)階段,溫度區(qū)間的不同可能是魚種的不同和實(shí)驗(yàn)的差異所造成。在降溫過程中,G’迅速增大,說明快速降溫有利于凝膠結(jié)構(gòu)的形成。Sun Fengyuan[29]、Sun Xiangdong[30]等研究也有相同結(jié)論。總體上,魚糜凝膠形成需經(jīng)歷升溫和降溫兩個(gè)過程,在升溫過程中應(yīng)當(dāng)避開G’迅速降低的溫度區(qū)段;因此在實(shí)踐中通常采用二段式加熱的方法,經(jīng)高溫凝膠化后,迅速冷卻會(huì)使魚糜凝膠結(jié)構(gòu)形成更充分。5 kGy輻照后低溫凝膠化階段優(yōu)勢(shì)并不明顯,但高溫凝膠化過程中G’的增長趨勢(shì)明顯強(qiáng)于對(duì)照組,可能是由于輻照暴露了相關(guān)活性基團(tuán),使凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)充分形成。
電子束輻照處理引起梅魚魚糜化學(xué)作用力和流變特性的變化,并進(jìn)一步影響熱誘導(dǎo)所形成的魚糜凝膠的色澤、質(zhì)構(gòu)及其流變特性;在梅魚魚糜熱誘導(dǎo)凝膠過程中,魚糜蛋白疏水力和二硫鍵是穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)作用力。綜合比較不同劑量(0、1、3、5、7、9 kGy)輻照后的梅魚魚糜凝膠持水性、白度及質(zhì)構(gòu)等指標(biāo),并結(jié)合SDS-PAGE結(jié)果,確定電子束前處理梅魚魚糜合適的輻照劑量為5 kGy。測(cè)定輻照前后魚糜的流變學(xué)指標(biāo),發(fā)現(xiàn)5 kGy組魚糜G’高,而tan δ低。此外,在變溫實(shí)驗(yàn)中確定了梅魚魚糜凝膠形成過程中的3 個(gè)溫度階段,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中有待優(yōu)化二段式加熱條件,進(jìn)一步增強(qiáng)5 kGy輻照前處理對(duì)魚糜凝膠品質(zhì)的改善作用。