宋林珍，朱麗云*，高永生,3，李素芳，張擁軍

（1.中國計量大學 海洋食品加工質(zhì)量控制技術(shù)與儀器國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江 杭州 310018；2.中國計量大學現(xiàn)代科技學院，浙江 杭州 310018；3.安徽漢芳生物科技有限公司，安徽 淮北 235000）

糖尿病是一種常見的、多病因的、有遺傳傾向的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病[1-2]，已成為當今威脅人類健康的第三大疾病。目前糖尿病臨床治療主要是注射胰島素、口服磺酰脲類和雙胍類降血糖藥物，從而達到降低血糖的目的。這類藥物作用強、見效快，但都存在不同程度的毒副作用[3]，無法從根本上阻止胰島細胞的進一步壞死，且往往導致胰島素依賴?？诜堤撬幬飳е碌脱牵踔烈驗閲乐氐脱腔杳远z留腦功能不全后遺癥或死亡是降糖藥物的不良反應之一，而且其危險性隨著年齡的增長呈指數(shù)性增加。在中國及日本民間常用粗老茶治療糖尿病[4-5]。茶多糖是茶葉中一類水溶性復合多糖，以茶葉細胞壁的結(jié)構(gòu)成分形式存在，已有研究表明茶多糖具有抗氧化[6-7]、抗癌[8]、免疫調(diào)節(jié)[9]和降血糖[10]等作用。Nie Shaoping等[11]的小鼠實驗中，茶多糖飲食顯著降低了小鼠的空腹血糖指數(shù)和糖基化血清蛋白含量。Zhou Xiaoling等[12]通過高效凝膠滲透色譜分析茶多糖的分子質(zhì)量分布和組成成分，發(fā)現(xiàn)100～120 kDa級組分有降血糖活性，并推測可溶性茶多糖是茶中主要的降血糖因子。綠茶、烏龍茶、紅茶的茶多糖均具有降血糖活性[13]，且在低劑量下半發(fā)酵烏龍茶和發(fā)酵紅茶降血糖活性優(yōu)于非發(fā)酵綠茶，茶葉產(chǎn)地、種類、工藝等對降血糖作用的發(fā)揮存在影響，可能是茶多糖結(jié)構(gòu)的復雜性使降血糖功能存在差異。本研究選擇浙江龍井茶葉為原料，提取并探討了茶多糖的結(jié)構(gòu)及其降糖功能特性，從動物體內(nèi)抗氧化活性、胰島β細胞損傷修復及其胰島素分泌功能變化等角度分析茶多糖的降糖機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑

ICR小鼠20 只，雄性，體質(zhì)量（20.0±1.1）g，由杭州師范學院動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)房溫度（23±1）℃，相對濕度（55±2）%。遵循國家及提供實驗動物單位的實驗動物福利規(guī)則和制度。

龍井茶葉購自杭州梅家塢；單糖標準品：鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-巖藻糖、D-葡萄糖醛酸、四氧嘧啶（alloxan，ALX）、格列本脲 美國Sigma公司；葡聚糖標準品（分子質(zhì)量分別為158 100、31 200、20 100、4 300、505、180 Da） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；乙醇、氯化鈉、溴化鉀、硫酸、波恩試劑、石蠟、鹽酸、碳酸鋰、蘇木精、伊紅 杭州米克化工有限責任公司；胰島素定量檢測試劑盒 上海裕平生物科技有限公司；血糖測定試劑盒 北京中生生物工程技術(shù)公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

159型高效液相色譜儀、2014C氣相色譜儀 日本島津公司；I3型紫外（ultraviolet，UV）-可見分光光度計 濟南海能儀器股份有限公司；YXQ-LS-50G型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司；DL-5M型離心機 湖南星科科學儀器有限公司；血糖監(jiān)測儀強生（上海）醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶多糖的制備與純化

將龍井粗老茶葉粉碎，將茶粉與水以1∶20的料液比混合，80～90 ℃下恒溫水浴振蕩1～2 h，離心收集上清液，濾渣重新水提2～3 次，離心合并上清液并真空濃縮，以1∶4的體積比用乙醇溶液醇沉過夜，取沉淀干燥得粗茶多糖。取一定粗茶多糖，采用Sevag法（溶劑為氯仿-正丁醇（體積比5∶1））除去蛋白質(zhì)，重復3～5 次，直至溶液振蕩后水層上方不再有白色泡沫為止。將經(jīng)脫蛋白后的茶多糖溶解于水中，透析，經(jīng)Sephadex-G 100凝膠色譜柱分離純化后得到茶多糖溶液，50 ℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到純化的茶多糖。

1.3.2 茶多糖分子質(zhì)量的測定

分子質(zhì)量的測定參考陳萍等[14]的高效凝膠滲透色譜法，選用TSK-GEL G4000（7.8 mm×300 mm）凝膠色譜柱，示差折光檢測器檢測，流動相為蒸餾水，洗脫流速為0.4 mL/min，柱溫35 ℃，壓強60.1 MPa，進樣量20 μL，樣品溶液用0.45 μm的濾膜過濾，洗脫液經(jīng)超聲脫氣處理。先后測定分子質(zhì)量為158 100、31 200、20 100、4 300、505、180 Da的葡聚糖，以保留時間與分子質(zhì)量的對數(shù)繪制標準曲線。茶多糖的分子質(zhì)量以保留時間對照標準曲線計算。

1.3.3 茶多糖的單糖組成分析

取茶多糖20 mg溶于3 mL 2 mol/L HCl溶液，105 ℃水解4 h，55 ℃真空濃縮。衍生化處理：加入0.5 mL吡啶和10 mg鹽酸羥胺，90 ℃保溫反應30 min，然后加入0.5 mL乙酸酐，90 ℃保溫30 min，待樣品冷卻后取上清液進行氣相色譜分析。標準單糖烘干至質(zhì)量恒定，分別取10 mg經(jīng)衍生化處理后進行氣相色譜分析，以標準單糖的保留時間對茶多糖中的單糖進行定性，將標準單糖配成不同濃度進樣，以標準單糖濃度與峰面積作標準曲線對茶多糖中的單糖進行定量。

氣相色譜條件：O V-1 7 0 1中等極性色譜柱（30 m×0.53 mm，1.0 μm），氫火焰檢測器，程序升溫：150 ℃（7 ℃/min）→190 ℃（15 ℃/min）→250 ℃保持7 min；進樣量：0.1 μL，載氣流速：1.5 mL/min。

1.3.4 光譜分析

UV光譜的檢測：稱取樣品各3 mg，用蒸餾水配制成一定質(zhì)量濃度的溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行全掃描。

紅外（infrared，IR）光譜分析：取茶多糖樣品1～2 mg，KBr壓片進行IR光譜分析。光譜測定范圍4 000～400 cm-l。

1.3.5 小鼠糖尿病模型（ALX模型）的建立與分組

小鼠適應性飼養(yǎng)3 d，第4天禁食不禁水12 h，用質(zhì)量分數(shù)1% ALX-生理鹽水溶液對ALX模型組、陽性組和藥物組小鼠進行腹腔注射，注射劑量為200 mg/kg，陰性組注射等量生理鹽水。72 h后測血糖，以血糖濃度在11.1～25.0 mmol/L之間的小鼠為成功的ALX模型小鼠。根據(jù)小鼠血糖濃度與體質(zhì)量隨機分為4 組（陰性組、模型組、藥物組和陽性組，每組5 只），以苦味酸為標記物，藥物組對ALX模型小鼠每日茶多糖灌胃100 mg/kg，連續(xù)6 周，陰性組和模型組以等劑量生理鹽水灌胃，陽性組以20 mg/kg格列本脲灌胃[9,15]。每天觀察小鼠體征，如采食、飲水、精神狀態(tài)、毛色等。

1.3.6 生理指標測定

藥物作用6 周后，斷頸脫臼法處死小鼠，解剖取胰、腎和肝，稱質(zhì)量。分別取各組小鼠血漿、肝臟和胰臟進行血糖濃度、肝糖原含量、胰島素水平等生化指標的測定，實驗設兩組平行。給藥后8.0 h尾靜脈采血，使用血糖監(jiān)測儀測定小鼠的血糖濃度。肝糖原含量采用苯酚-硫酸法測定。胰島素水平參照小鼠胰島素定量檢測試劑盒說明書進行測定。

1.3.7 體內(nèi)抗氧化指標測定

測定血清與肝臟的抗氧化相關(guān)指標。SOD、GR、CAT、NOS活力和MDA、NO含量均按照試劑盒說明書的方法檢測。

1.3.8 胰島、肝臟組織切片觀察

分別取各組小鼠新鮮胰臟、肝臟浸泡于波恩試液中固定24 h，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、預融的石蠟包埋、修塊、切片、固定、蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色后顯微鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有結(jié)果表示為±s。使用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行統(tǒng)計分析，通過t檢驗確定差異性，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠柱色譜分析茶多糖分子質(zhì)量結(jié)果

圖 1 茶多糖分子質(zhì)量測定結(jié)果Fig. 1 Molecular mass determination of the polysaccharide by high performance liquid chromatography

采用凝膠色譜分析不同分子質(zhì)量的葡聚糖，以保留時間為橫坐標，以分子質(zhì)量的對數(shù)為縱坐標，得到標準曲線y＝-0.258 4x+7.831 4，線性相關(guān)系數(shù)為0.963 9，線性良好，可滿足分子質(zhì)量測定要求。凝膠滲透法和高效液相色譜法的測定結(jié)果表明，從粗老茶葉中分離得到的水溶性多糖為均一多糖，根據(jù)保留時間（t＝10.599 3 min）從回歸方程中求得茶多糖的分子質(zhì)量為119 600 Da。

2.2 氣相色譜分析茶多糖的單糖組成結(jié)果

圖 2 標準單糖的氣相色譜測定結(jié)果Fig. 2 Gas chromatogram of monosaccharides in standard sample

如圖2所示，混標中各單糖的出峰順序依次為D-葡萄糖醛酸、鼠李糖、D-巖藻糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖?；鞓诉M樣6 次，得到其出峰時間及面積相對標準偏差均小于5%，表明該乙酰化方法可行。將各單糖稀釋成不同的濃度進樣，得到峰面積y與濃度x的標準曲線如下：D-葡萄糖醛酸：y＝4 207.80x-528.77，R2＝0.997 4；鼠李糖：y＝56 047.0x+5 347.6，R2＝0.998 5；D-巖藻糖：y＝88 196.0x-6 171.4，R2＝0.997 4；L-阿拉伯糖：y＝46 820.0x+2 713.9，R2＝0.999 0；D-木糖：y＝55 832.0x-2 590.0，R2＝0.996 4；D-甘露糖：y＝84 690.0x-2 731.0，R2＝0.999 9；D-葡萄糖：y＝90 347x-12 953，R2＝0.995 7；D-半乳糖：y＝82 177x-10 792，R2＝0.995 9。根據(jù)標準曲線計算得到D-葡萄糖醛酸、鼠李糖、D-巖藻糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖的濃度分別為2.915、0.089、0.488、0.727、0.343、0.212、1.373、0.672 mmol/mL。

圖 3 茶多糖的單糖組成氣相色譜測定結(jié)果Fig. 3 Gas chromatogram of monosaceharides in the polysaccharide

如圖3所示，根據(jù)各峰保留時間對應各單糖標準品，可知茶多糖由D-葡萄糖醛酸、鼠李糖、D-巖藻糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖8 種單糖組成，根據(jù)各單糖的標準曲線計算得到各單糖的物質(zhì)的量比為32.61∶1.00∶5.46∶8.13∶3.84∶2.37∶15.36∶7.52。

2.3 UV和IR光譜結(jié)果

圖 4 茶多糖的UV光譜掃描結(jié)果Fig. 4 UV absorption spectrum of the polysaccharide

由圖4可知，在220～400 nm波長范圍內(nèi)，多糖溶液的吸光度呈下降趨勢。在280 nm和260 nm波長處基本沒有吸收峰，說明本實驗分離得到的茶多糖不含蛋白質(zhì)和核酸。

圖 5 茶多糖的IR掃描結(jié)果Fig. 5 IR spectrum of the polysaccharide

樣品在4 000～400 cm-1區(qū)具有多糖類物質(zhì)的一般特征峰（圖5），在3 423.36、2 939.52、2 345.44、1 737.86、1 622.13、1 431.18、1 247.94、1 085.00、1 022.99 cm-1處均有特征吸收。3 423 cm-1附近的強寬譜帶是多糖分子中羥基的伸縮振動吸收峰；2 345 cm-1處為CO2氣體的伸縮振動引起的雜峰；2 939 cm-1附近的吸收峰是甲基或亞甲基的C—H伸縮振動峰；在1 622 cm-1處的寬帶與吸收的水相關(guān)，表明茶多糖對水分子具有較強的親和力；在1 450～1 200 cm-1之間的峰是C—H的變角振動，與C—H的伸縮振動構(gòu)成了糖環(huán)的特征吸收；1 075 cm-1處為主鏈上的半乳糖吡喃環(huán)的伸縮振動；1 025 cm-1處為側(cè)鏈阿拉伯呋喃環(huán)；1 730 cm-1附近為糖醛酸的特征吸收峰。IR測定結(jié)果與糖醛酸氣相色譜測定結(jié)果一致，表明茶多糖很可能為一種酸性雜多糖。

2.4 各組小鼠生化指標的測定結(jié)果

由表1可知，造模后小鼠出現(xiàn)了多飲、多食、多尿的狀況，飼養(yǎng)6 周后體質(zhì)量沒有明顯增加，并有反應相對遲鈍、被毛雜亂無光等癥狀，在給予200 mg/（kg·d）茶多糖治療后小鼠以上癥狀得到改善，且血糖濃度降為正常水平。陰性組小鼠體質(zhì)量增加顯著，并呈現(xiàn)肥胖狀態(tài)，飼養(yǎng)6 周后血糖濃度有所增加。陰性組、模型組和藥物組小鼠經(jīng)6 周飼養(yǎng)后肝臟質(zhì)量無顯著差異性（P＞0.05），而藥物組小鼠肝糖原含量顯著升高（P＜0.05），達到41.62 mg/g肝質(zhì)量，表明茶多糖在降低糖尿病小鼠血糖濃度的同時促進葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃?。模型組小鼠胰臟質(zhì)量與陰性組、藥物組小鼠無顯著差異，但血漿中胰島素水平均顯著低于陰性組和藥物組小鼠（P＜0.05），可能是ALX在體內(nèi)能選擇性地作用于小鼠的胰島β細胞，所產(chǎn)生的過量自由基能破壞β細胞的結(jié)構(gòu)，導致小鼠的胰腺腫脹肥大、損傷和壞死，使胰島素水平降低，而藥物組茶多糖可能對胰臟存在保護作用。

表 1 各組小鼠生化指標測定結(jié)果Table 1 Biochemical parameters of mice from different groups

2.5 各組小鼠生化指標的測定結(jié)果

表 2 茶多糖對糖尿病小鼠血清及肝臟中抗氧化指標的影響Table 2 Effect of the polysaccharide on antioxidant indexes in serum and liver of diabetic mice

如表2所示，藥物組和陽性組小鼠血清中GR、SOD和CAT活力均高于模型組，與模型組相比，藥物組和陽性組的SOD活力顯著升高（P＜0.05），且與陰性組無顯著差異。而GR和CAT活力各組間均無顯著差異。

肝臟是動物和人體內(nèi)最重要的器官，它是糖類、脂肪、蛋白等代謝的最主要的場所之一。肝臟能促進糖原合成、利用葡萄糖，對糖異生等途徑有抑制作用，從而使血糖降低，還能清除體內(nèi)毒素及促進分泌性蛋白質(zhì)合成。

GR、SOD和CAT是肝臟中主要的抗氧化活性酶，從表2中可知，茶多糖藥物組小鼠肝臟中GR、CAT和SOD活力均顯著高于模型組及陰性組（P＜0.05）。NOS活力的升高將導致NO含量的增加。NO和MDA是肝臟中主要的有毒氧化產(chǎn)物，這兩個指標在模型組中達到最高，說明模型組小鼠在ALX作用下可能引起肝損傷，影響肝臟功能。而經(jīng)過茶多糖或陽性藥物治療的小鼠肝臟中NOS活力和MDA含量接近正常組水平，且NO含量顯著低于模型組（P＜0.05），說明茶多糖和陽性藥物發(fā)揮了抗氧化的作用，可能與GR、SOD和CAT活力的升高有關(guān)。由實驗結(jié)果可知，茶多糖藥物組和陽性組小鼠均具有較好的體內(nèi)抗氧化效果。

2.6 茶多糖對小鼠胰島組織、肝臟的影響

ALX進入機體內(nèi)可迅速被β細胞攝取，產(chǎn)生氧自由基，選擇性地損傷多種動物的胰島β細胞，引起實驗性糖尿病。糖尿病小鼠胰島結(jié)構(gòu)被明顯破壞，胰島細胞明顯減少，胰島β細胞的細胞器明顯受損、分泌顆粒明顯減少，胰島素分泌降低。

胰島細胞為胰腺的內(nèi)分泌細胞，分布于腺泡之間，HE染色切片中胰島色淺，為球形的細胞團，細胞間毛細血管豐富。陰性組胰島組織學檢查顯示外分泌腺中腺泡細胞的結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)分泌區(qū)域的胰島外觀完整，胰島細胞內(nèi)的小深藍紫色顆粒和少量粉紅色顆粒分布一致（圖6A）。模型組與陽性組胰島細胞結(jié)構(gòu)不清，胰腺具有許多不規(guī)則的腺泡細胞，出現(xiàn)空泡化和細胞壞死（圖6B、D）。藥物組胰島細胞排列成團狀，細胞圓潤飽滿，從圖6C中可看出已得到修復。

圖 7 茶多糖對小鼠肝臟組織形態(tài)的影響（×100）Fig. 7 Effect of the polysaccharide on liver tissue morphology in mice (× 100)

如圖7所示，正常組與藥物組肝細胞體積大、胞質(zhì)豐富、HE染色較紅，胞質(zhì)內(nèi)含有粒狀或小塊狀的嗜堿性物質(zhì)。而模型組肝細胞呈現(xiàn)碎片狀，有部分壞死現(xiàn)象。

3 討 論

3.1 茶多糖的分子結(jié)構(gòu)

多糖結(jié)構(gòu)與功能的研究中，一般結(jié)構(gòu)上從多糖分子質(zhì)量范圍、單糖組成、糖鏈中糖苷鍵連接類型和連接順序等一級結(jié)構(gòu)著手，進一步分析單糖殘基類型、主鏈和支鏈組成與連接位點、重復單元等多糖結(jié)構(gòu)[16-17]。Wang Yuanfeng等[18]發(fā)現(xiàn)茶葉多糖分子質(zhì)量分布范圍分別為3.67×103～7.58×105Da，與本研究所測茶多糖分子質(zhì)量約為119 600 Da基本一致。倪德江等[19]認為烏龍茶多糖是富含糖醛酸和少量蛋白質(zhì)的三元糖復合物，相對分子質(zhì)量為8.877×104，糖基由半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、巖藻糖和鼠李糖組成，與本研究中茶多糖的單糖組成存在差異性，可能為原料來源和提取方法不同所致。多糖的相對分子質(zhì)量、單糖組成等基本理化參數(shù)對多糖的結(jié)構(gòu)起基礎性決定作用，與其生物活性緊密相關(guān)[20]，即使同一來源原料后續(xù)純化方法不同，也會獲得理化特性各異的茶多糖（組分），從而造成其生物活性的差異，這是茶多糖純化及生物活性研究中探索其組效關(guān)系和構(gòu)效關(guān)系方面值得注意的環(huán)節(jié)。

3.2 天然多糖降血糖活性與機制

ALX在體內(nèi)能選擇性地作用于小鼠胰島β細胞，所產(chǎn)生的過量自由基能破壞β細胞的結(jié)構(gòu)，導致小鼠的胰腺損傷和壞死，胰島素水平降低，出現(xiàn)糖尿病癥狀[21]。根據(jù)文獻[15,22]報道，多糖的降糖主要作用機制為降低肝糖原含量、刺激胰島素分泌、調(diào)節(jié)機體代謝相關(guān)酶活力（如與抑制葡萄糖運轉(zhuǎn)載體競爭；使α-淀粉酶、蔗糖酶活力降低；α-葡萄糖苷酶對糖原異生與分解的調(diào)節(jié)[23]；6-磷酸葡萄糖苷酶體系的作用等），或者通過減弱氧化應激等方面來發(fā)揮有益作用。

本研究從龍井粗老茶葉中提取、純化獲得的茶多糖通過灌胃給藥取得了較好的降糖效果，經(jīng)過42 d作用后，藥物組小鼠血糖濃度從18.98 mmol/L降為5.80 mmol/L，達到正常范圍（3.90～6.20 mmol/L），與陰性組無顯著差異（P＞0.05），表現(xiàn)出茶多糖極好的降血糖活性，與江和源等[24]的研究結(jié)果相似。Niedowicz等[25]報道糖尿病患者和實驗動物模型均顯示持續(xù)性和慢性高血糖癥引起高氧化應激，使抗氧化防御系統(tǒng)活性下降并促進自由基產(chǎn)生。抗氧化劑被認為通過抑制過氧化反應鏈來減輕β細胞的破壞[26]，與本研究中茶多糖具有促進ALX糖尿病小鼠胰島β細胞的修復、胰島素分泌增加、肝臟SOD、CAT和GR活力提高、保護肝臟組織免受ALX引起的氧化損傷的功能的研究結(jié)果一致。胰島β細胞功能異常和凋亡是糖尿病發(fā)病過程中的關(guān)鍵步驟[27-29]，改善β細胞功能、促進β細胞再生應是糖尿病治療的重點。從胰島組織切片結(jié)果觀察，茶多糖藥物組胰島細胞排列成團狀，細胞圓潤飽滿，顯著修復了模型組胰島β細胞結(jié)構(gòu)不清、胰腺具有許多不規(guī)則的腺泡細胞、出現(xiàn)空泡化和細胞壞死等病理形態(tài)，預示茶多糖對胰島細胞的修復及胰島素分泌具有積極的作用。

茶多糖在體內(nèi)的降血糖活性受到許多因素的影響，包括化學成分、分子質(zhì)量、糖苷鍵的配置和位置、分支點和單糖序列[30]，以及劑量、用藥時間和作用途徑等，茶多糖的吸收方式及降糖作用靶點等有待于進一步研究。