骨骼與性腺的交互作用及運動調(diào)控機制

徐帥 李世昌

摘 要：近年來骨骼作為獨立的內(nèi)分泌器官越來越受到研究者的認可，其分泌的骨鈣素可作用于性腺，調(diào)節(jié)GPRC6A的分泌，從而影響睪酮的含量，最終改善男性生殖能力。GPRC6A又可反過來刺激骨骼的生長，促進骨健康；GPRC6A還參與骨鈣素作用下的糖穩(wěn)態(tài)，刺激胰腺中β細胞分泌胰島素。運動干預能夠增強骨內(nèi)分泌功能，增加骨鈣素分泌量，引起GPRC6A水平升高，睪酮水平上升。

關鍵詞：骨鈣素；性腺；生殖能力；GPRC6A；運動

中圖分類號：G804.7 文獻標識碼：A 文章編號：1006-2076（2018）02-0081-06

Abstract：It has been widely recognized by researchers in recent years that bone is an independent endocrine organ. Bone secreted osteocalcin（OCN） can act on testis， then regulate GPRC6A secretion and progressively effect testosterone concentration， which consequently improves male fertility. In return， GPRC6A can stimulate bone development， improve bone health； GPRC6A also participate in glucose steady state under the action of OCN， stimulating the secretion of insulin of pancreatic β-cell. Exercise intervention can enhance bone endocrine function， increase the amount of OCN secretion， cause GPRC6A and testosterone levels rise.

Key words：osteocalcin； gonad； male fertility； GPRC6A； exercise

骨鈣素（osteocalcin， OCN）作為骨骼中最豐富的蛋白質(zhì)之一，最初僅被認為是骨礦化的抑制劑，最新研究發(fā)現(xiàn)，OCN具有更廣泛的全身性作用：新陳代謝、繁殖能力和認知調(diào)節(jié)。由胰島素調(diào)控的OCN在反饋環(huán)節(jié)中，可增加β細胞增殖以及胰島素的分泌；提高神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞；會刺激男性睪丸的分泌活性，調(diào)節(jié)男性生殖功能，改善生育能力[1]。運動減肥、運動減脂的科學性已經(jīng)得到證實，運動可直接提高骨質(zhì)量，促進骨分泌活性，骨骼通過分泌OCN進一步刺激睪酮的合成，改善生殖能力。本研究主要通過骨分泌環(huán)節(jié)闡述生殖活性，為運動改善骨健康以及性發(fā)育功能提供新的思路。

1 對骨骼的新認識

骨骼一直被認為是靜態(tài)結(jié)締組織，起到支持和保護的作用，同時也是運動的必要條件。對脊椎動物研究發(fā)現(xiàn)，器官之間的相互依賴是潛在的生物學現(xiàn)象。最新研究表明，骨不僅是荷爾蒙輸入受體，其本身也是一個內(nèi)分泌器官。目前發(fā)現(xiàn)骨骼可分泌2種激素：一種是成纖維細胞生長因子23（fibroblast growth factor 23， FGF23），可通過控制磷酸鹽穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)礦物質(zhì)代謝與骨健康；另外一種是OCN，可作用于胰島素和性腺，調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)和雄性生殖功能。OCN是由成骨細胞和骨細胞特異性分泌的激素，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，其分子量為6 kDa，占非膠原蛋白的10%～20%。OCN在體內(nèi)主要以2種形態(tài)存在：羧化不全骨鈣素（uncarboxylated osteocalcin， uOCN）和羧化完全骨鈣素（carboxylated osteocalcin， cOCN）。其中uOCN與骨的結(jié)合能力低，包含0～2個γ-羧基谷氨酸殘基，參與血液循化并激活多組織的生物功能；而cOCN無活性，主要存儲在骨基質(zhì)中。

骨骼的發(fā)生發(fā)展貫穿著整個生命歷程，其中骨重建（bone remodeling）是一種雙向過程：以破骨細胞介導的骨吸收；以成骨細胞介導的骨形成。甲狀腺功能亢進患者具有高骨轉(zhuǎn)換的狀況，高轉(zhuǎn)換引起的較高OCN，緊跟著較高的睪酮形成[2]。骨重建是由機械刺激、各類因子和激素共同作用的結(jié)果。性固醇類激素在青春期的骨骼發(fā)育階段起著重要作用：雌激素對雌雄個體骨骼的發(fā)育、成熟和構塑、重建、維持骨量平衡具有重要的調(diào)節(jié)功能；雄激素對骨骼也具有調(diào)控作用[3]。值得關注的是，骨骼對雄激素的分泌也具有一定的調(diào)節(jié)作用，當OCN羧基化后，uOCN與G蛋白偶聯(lián)受體GPRC6A結(jié)合，作用于Leydig細胞促進睪酮合成。最近還發(fā)現(xiàn)，OCN通過胰腺-性腺軸（pancreasbone-testis axis）發(fā)揮作用，獨立于傳統(tǒng)的下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamus-pituitary-testis axis， HPGA）并與其平行調(diào)節(jié)。[4-5]

2 睪酮的分泌

雄性激素是一類含19個碳原子的類固醇激素，其中睪酮的生物活性遠遠高于其他的代謝物，睪酮是由Leydig細胞分泌的一類雄激素，作為生育的必要調(diào)節(jié)物，可通過支持細胞活性、促進生殖細胞存活，調(diào)節(jié)雄性生殖系統(tǒng)[6]，由基礎分泌方式和促性腺激素誘導分泌方式共同分泌。促性腺分泌受HPGA調(diào)節(jié)，通過刺激促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone， GnRH）的合成與分泌，引起黃體生成素（luteinizing hormone， LH）的釋放，LH與Leydig細胞膜的受體結(jié)合，通過環(huán)磷酸腺苷（cyclic Adenosine monophosphate， cAMP）通路引起的磷酸化，使得膽固醇進入線粒體，最終引起睪酮的生成。除了傳統(tǒng)的下丘腦傳導通路，已經(jīng)證明胰腺-骨-性腺軸（pancreas-bone-testis axis）是一種新型的調(diào)節(jié)男性生殖功能的結(jié)構[7-8]。機體通過胰腺分泌胰島素并作用于成骨細胞，引起OCN合成，在pH 4.5的骨環(huán)境中引起骨吸收脫羧化，從而激活OCN形成有活性的OCN，uOCN可通過血液循環(huán)進入到睪丸組織中，與OCN的受體結(jié)合，同樣引起cAMP通路的磷酸化，導致下游因子的進一步反應，從而提高睪酮合成，最終引起生殖細胞存活和精子發(fā)生能力提高，同時uOCN又可反作用于胰腺，引起β細胞增殖、分化和胰島素的分泌，形成骨內(nèi)分泌回路[9]，同時胰島素再進一步作用于骨骼，從而提高OCN的合成。

3 骨骼與性腺

由成骨細胞分泌的激素OCN可進行一系列的調(diào)節(jié)，OCN經(jīng)羧化后形成uOCN，促進β細胞增殖、胰島素分泌以及肌肉、肝、白色脂肪細胞中胰島素的敏感性。uOCN支持體內(nèi)的糖穩(wěn)態(tài)和能量代謝等功能[10]，uOCN又通過促進男性生殖能力提高睪丸中睪酮的分泌。向野生型小鼠體內(nèi)注射OCN，可明顯提高血睪酮的含量；而雄性OCN-/-小鼠由于睪酮含量的下降，會引起睪丸體積、附睪重量和精子發(fā)生顯著下降；雌性OCN-/-小鼠卻不會出現(xiàn)卵巢和性激素水平的異常[11-12]，說明OCN對雄性小鼠的生殖能力起到重要的調(diào)控作用。而性固醇類激素亦可提高骨含量并維持骨量。絕經(jīng)女性由于卵巢雌激素分泌減少，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率顯著高于男性，男性的骨強度更高，骨折的風險較低。而若減少雄激素的分泌，或閹割雄性睪丸，均會引起骨量下降[13-14]。換言之，睪酮對骨骼具有反作用能力，兩者是相互作用的關系。

3.1 骨內(nèi)分泌對生殖能力的調(diào)控

對成骨細胞中缺乏胰島素受體的小鼠（InsRosb-/-小鼠）進行正常飼養(yǎng)，出現(xiàn)葡萄糖不耐受和胰島素不敏感的現(xiàn)象，這與OCN-/-小鼠表型相似。而在骨骼肌或脂肪組織中缺乏胰島素受體并不會出現(xiàn)葡萄糖不耐受情況。InsRosb-/-小鼠具有較低的uOCN活性，也揭示了成骨細胞中胰島素信號傳遞是OCN的決定因素。胰島素可抑制成骨細胞中護骨素（osteoprotegerin， OPG）的表達，從而很好地阻礙破骨細胞分化。也就是說，胰島素信號通過激活OCN達到自身的分泌，此外，小鼠與人的骨吸收障礙，也會導致OCN的羧基化減弱，導致葡萄糖不耐受[4]，最終還是引起睪酮合成受阻。

細胞生物學研究發(fā)現(xiàn)，成骨細胞通過體外培養(yǎng)Leydig細胞，可顯著提高睪酮的分泌量。其特異性以3種方式得到證實：1）成骨細胞培養(yǎng)的上清液不能提高卵巢中性固醇類激素的生成；2）不能誘導Leydig細胞分泌雌二醇；3）無其他間質(zhì)干細胞具有成骨細胞的此種功能[11]。且成骨細胞的此種功能在體內(nèi)也得到了證實[15]。成骨細胞分泌的OCN可作用于2個靶細胞：β細胞和Leydig細胞。動物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，成骨細胞對睪酮水平有重要作用，在DTAobs小鼠中，即一種成骨細胞缺失小鼠模型，消融成骨細胞后會影響成年老鼠的睪酮循環(huán)水平[15]。OCN缺陷小鼠可抑制LH水平[7]，同時觀察LH對OCN的生成是否具有調(diào)節(jié)功能，在OCN-/-小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)OCN和LH是2條平行的調(diào)控通路，OCN通過胰島素信號和骨吸收刺激睪酮合成。進一步對原發(fā)性睪丸衰竭患者的研究發(fā)現(xiàn)，GPRC6A跨膜結(jié)構的錯義發(fā)生，抑制了受體細胞膜局部化?，F(xiàn)在提出的問題是：OCN的下游靶目標是LH，還是說存在“垂體介導”和“骨骼介導”兩種獨立的結(jié)構，其兩者對男性生殖能力的調(diào)節(jié)是否都具有重要的作用？如果“骨骼介導”因素是重要的調(diào)控基質(zhì)，那么OCN又是如何調(diào)節(jié)生殖功能的？OCN在小鼠中的表現(xiàn)又可否在人體中表達？體內(nèi)外研究指出：1）在共培養(yǎng)條件下，未敲除成骨細胞OCN的野生型小鼠，引起睪丸中Leydig細胞增加，使得睪酮的生成；2）當uOCN含量升高時，引起Leydig細胞分泌提高；3）對野生型小鼠注射OCN可提高睪酮循環(huán)水平，可修復成骨細胞缺乏小鼠中由于OCN不足，引起睪酮分泌降低的狀況[11]。在OCN不足小鼠中，其睪丸、附睪及精囊的重量均下降，而雄性Esp-/-小鼠出現(xiàn)相反現(xiàn)象。雄性OCN-/-小鼠精子數(shù)下降50%，而雄性Esp-/-小鼠卻相應升高30%，Leydig細胞的成熟率由于OCN的缺失而受到阻礙，也說明了OCN有助于睪酮合成，睪酮水平在OCN-/-小鼠中低，而在Esp-/-小鼠中高，雌激素在OCN-/-小鼠和Esp-/-小鼠中維持在正常范圍。Esp與OCN呈現(xiàn)相反的表達功能，Esp通過抑制OCN羧化抑制其活性。雄性OCNobs-/-小鼠與OCN-/-小鼠有相同的睪酮生成，而敲除Leydig細胞中OCN則不會影響雄性生殖能力。此外，Leydig細胞的成熟會因OCN的缺乏而停止，這些特征說明OCN對睪酮合成起重要作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，通過提高血清OCN的羧化，會提高成骨細胞中胰島素信號對葡萄糖和睪酮的調(diào)節(jié)[16]。

G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor， GPCR）存在于Leydig細胞中，GPCR家族中C家族6組A——GPRC6A作為OCN受體，也是目前唯一被確定的OCN受體[17]，是一種氨基酸感應G蛋白偶聯(lián)受體，GPRC6A失活小鼠引起的代謝和生殖表型與OCN-/-小鼠相類似，而OCN和GPRC6A均缺乏的雄性小鼠，可引起雌二醇循環(huán)水平顯著升高，導致睪酮/雌二醇比率下降。同時，GPRC6A-/-小鼠還可引起復雜的代謝異常，包括肥胖、葡萄糖不耐受、肝脂肪變性、胰島素抵抗、高磷酸鹽血癥、骨質(zhì)減少、肌肉衰減以及睪酮減少[18]。另外，GPRC6A-/-小鼠存在與下丘腦分泌LH調(diào)節(jié)睪酮相對立的表征，而不是單純的抑制效果，也就是與HPGA相異常的生殖活性[19]。Oury[11]等對GPRC6A下游級聯(lián)反應物的研究發(fā)現(xiàn)，uOCN與GPRC6A結(jié)合，GPRC6A通過cAMP-PK系統(tǒng)（環(huán)一磷酸腺苷-磷酸激酶系統(tǒng)）催化ATP轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷cAMP，可引起cAMP含量升高并刺激其活性，使得cAMP與cAMP反應元素結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein， CREB）結(jié)合，引起CREB的磷酸化，CREB的激活會進一步提高睪酮生物合成的關鍵酶活性，使得膽固醇進入線粒體，最終引起睪酮含量的增加。其中的關鍵酶包括類固醇激素合成急性調(diào)控蛋白（steroidogenic acute regulatory protein， StAR）、Cyp11ɑ、3β-羥類固醇脫氫酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase， 3β-HSD）和Cyp17（一種細胞色素酶）。此外，人體間充質(zhì)干細胞內(nèi)cAMP/PKA/CREB通路的活化，還可引起骨形成[20]，形成共進共退的生理功能。

StAR幫助膽固醇從線粒體外膜轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)膜，參與類固醇合成。StAR 的快速合成主要是通過cAMP第二信使系統(tǒng)作用于翻譯和翻譯后加工過程，cAMP會明顯刺激StAR轉(zhuǎn)錄和mRNA的穩(wěn)定性變化。進入線粒體內(nèi)的膽固醇經(jīng)線粒體內(nèi)膜上的膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450SCC）催化，27個碳原子的膽固醇經(jīng)羥化、側(cè)鏈裂解形成21個碳原子的孕烯醇酮，而在3β-HSD和Cyp17將孕烯醇酮轉(zhuǎn)化為雄烯二酮，最終經(jīng)Δ5途徑生成睪酮[21]（圖1）。

3.2 性腺對骨的調(diào)控

性固醇類激素在骨骼的生長發(fā)育中起著重要的作用。臨床發(fā)現(xiàn)，性腺機能減退和血清睪酮下降是男性骨質(zhì)疏松的重要因素。雄激素對成長期的男性骨骼起著重要作用，由于青春期時性腺機能減退引起性激素缺乏，最終導致骨量降低，而睪酮可提高骨骺閉合前的骨量。成年男性的血清游離睪酮含量與皮質(zhì)骨大小成正相關[22]。睪酮可有效防止性腺機能減退的老年男性的骨量下降風險。GPRC6A在成骨細胞中也進行表達，GPRC6A-/-小鼠的會表現(xiàn)出礦化受損和成骨細胞功能下降。骨吸收引起的OCN釋放，可通過骨骼中GPRC6A的活化作用，刺激成骨細胞調(diào)節(jié)骨形成和骨礦化[18]。并與OCN共同作用于胰島素和β細胞，從而調(diào)節(jié)機體的葡萄糖水平和新陳代謝。

雄激素會直接影響于骨骼細胞，雄激素受體在成骨細胞、破骨細胞、骨細胞均可表達，雄激素對成骨細胞形成具有潛在的影響，并提高骨小梁的質(zhì)量和完整性[14]。在男性青春期時，由睪丸通過GPRC6A來調(diào)控LH的分泌，還有骨骼釋放的uOCN同樣可以調(diào)控睪丸活性再調(diào)節(jié)GPRC6A分泌，從而引起骨骼的生長和內(nèi)分泌功能的變化[23]。在細胞水平中，睪酮通過提高成骨細胞中OPG的合成，抑制破骨細胞活性；同時抑制成骨細胞分泌白細胞介素6（interleukin 6， IL-6），降低溶骨因子含量，減弱細胞凋亡從而增加成骨細胞壽命。此外，雄激素還刺激骨祖細胞增殖和成熟的成骨細胞分化。有研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β， TGFβ）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor， FGF）、胰島素樣生長因子II（insulinlike growth factor II， IGF-II）等可抑制骨吸收，促進骨組織發(fā)育，提高骨形成。雄激素通過提高TGFβ、FGF、IGF-II等因子的表達以改善成骨細胞增殖和分化功能[24]；最終引起骨結(jié)構的生長、維持和穩(wěn)態(tài)（圖1）。當pH降低時也會激活無活性TGFβ1，影響破骨細胞，抑制骨吸收，最終刺激成骨細胞前體細胞分化和增殖，提高骨量。

GPRC6A雖然也會在腦、心臟、腎臟等其他組織中表達，但其中的功能還需要進一步證實。更多的證據(jù)說明GPRC6A在炎癥反應、能量代謝和內(nèi)分泌系統(tǒng)中的作用，尤其是調(diào)控OCN介導的葡萄糖代謝水平[12]。其中OCN-GPRC6A循環(huán)體系可調(diào)節(jié)能量代謝和激素水平，OCN-/-GPRC6A-/-小鼠表現(xiàn)出糖耐量受損、胰島素抵抗、肥胖、脂肪肝和較低睪酮水平，而OCN+/-GPRC6A+/-小鼠又會出現(xiàn)代謝異常的累加效應；條件性敲除GPRC6A，會引起OCN介導的胰島素中β細胞和Leydig細胞中睪酮分泌量減少[25-26]。GPRC6A-/-小鼠與野生型小鼠相比，空腹胰島素水平下降、空腹血糖水平升高，胰腺重量、胰腺數(shù)目、胰島大小和胰島素含量等明顯下降；在進行胰島素耐量實驗中，GPRC6A-/-小鼠的胰島素敏感性也出現(xiàn)顯著下降[27]。Pi[28]等通過對HEK-293細胞中GPRC6A和OCN的表達量進行研究，發(fā)現(xiàn)OCN和GPRC6A結(jié)合后，可激活PLC-PKC/PKD1-ERK信號通路，該通路可刺激β細胞中胰島素的分泌[29]，同時還促進胰腺中β細胞的增殖。同時也證實了GPRC6A通過與OCN、 氨基酸（精氨酸、鳥氨酸等）結(jié)合，促進胰腺刺激胰腺β細胞增殖，誘導GLUTag細胞GLP-1 的分泌，從而對機體的糖穩(wěn)態(tài)進行調(diào)節(jié)[27]。

4 運動的調(diào)控作用

運動提高骨健康已經(jīng)得到證實，而運動如何通過骨骼影響睪酮水平還沒有統(tǒng)一的定論，尤其是針對運動對胰腺-骨-性腺軸的探索尚未有詳細報道。

運動提高小鼠中OPG、FGF、IGF和TGF的分泌量，引起成骨細胞的增殖和分化；抑制IL-6、RANKL的分泌量，導致破骨細胞活性降低，最終改善骨骼的生長、發(fā)育和維持，引起骨內(nèi)分泌OCN的活性升高。運動還可改善骨重建，進行8周的體育訓練（抗阻、抗阻與有氧結(jié)合）均可提高骨形成能力；且短期訓練也可提高骨形成標志物的升高[30]。有研究指出，短期體育鍛煉即可影響骨轉(zhuǎn)換，針對于骨代謝的變化，需要較長的時間適應物理負荷的變化[31]。Saydi[32]等人對47名青少年（12～17.9歲）身體活動進行調(diào)查，并用體力活動評分（A physical activity score， PAQsum）來量化身體活動（范圍1～5），發(fā)現(xiàn)日常體力活動較高的青少年（PAQsum為2.4±0.8），其OCN的水平遠高于較低活動量的青少年，而OCN和胰島素敏感性之間沒有統(tǒng)計學顯著的相關性。對4周齡的雄性wistar大鼠進行8周的遞增運動干預，跑臺組和跳躍組的OCN含量顯著高于控制組[33]。堅持有氧運動還可以提高精子質(zhì)量[34]，同樣的中等強度運動可減輕肥胖對精子生成的不利影響，增加睪酮分泌量[35]。對18～40歲的健康男性進行2個實驗：30 min的間歇訓練（90%～95%的峰值心率），再進行3小時的恢復和2小時的血糖-高胰島素鉗夾（胰島素鉗夾）實驗，指出uOCN在胰島素中的潛在作用，以及運動誘導胰島素敏感性的新途徑[36]。uOCN以GPRC6A介導的方式調(diào)節(jié)下游級聯(lián)反應。而對GPRC6A受體敲除小鼠（GPRC6A receptor knockout， KO）和野生型小鼠進行跑輪實驗，發(fā)現(xiàn)GPRC6A會影響小鼠自愿進行跑輪實驗，KO小鼠跑輪效果遠高于野生型小鼠，GPRC6A受體可參與調(diào)解運動的行為[37]，同時GPRC6A還可降低脂肪細胞中脂肪量和瘦素水平、增加肌肉質(zhì)量和線粒體數(shù)目，并降低脂肪肝變性[18，38]（圖2）。

綜上所述，運動改善骨健康，刺激OCN的分泌，從而調(diào)節(jié)GPRC6A的活性，提高睪酮含量；進一步，GPRC6A還可以改善脂肪組織、骨骼肌和肝的生理功能。GPRC6A還作為OCN在胰島素的敏感性受體，從而介導骨骼—胰腺之間的關系，調(diào)控胰島素的分泌。從運動的角度分析，運動作為復雜的物理刺激，不只是單一的線性作用，其中胰腺-骨-性腺軸也是相互交叉、相互影響的方式，這就需要從更廣泛的角度去把握OCN-GPRC6A循環(huán)體系，從而為雄性生殖提供更精準的思路。

5 展望

本研究從骨內(nèi)分泌角度對生殖功能進行探索，不僅說明運動對骨健康的改善，同時對骨內(nèi)分泌促進睪酮合成提供了新的機制。研究發(fā)現(xiàn)OCN-GPRC6A循環(huán)體系還具有調(diào)節(jié)能量代謝和糖穩(wěn)態(tài)作用，OCN作用于胰腺，影響胰島素的分泌；GPRC6A也可作用于β細胞，引起β細胞的增殖和胰島素的生成和分泌，共同調(diào)控血糖水平，這也為運動如何改善2型糖尿病提供了新的思路。大量研究發(fā)現(xiàn)GPRC6A與前列腺癌的發(fā)生存在聯(lián)系，如何通過GPRC6A的作用機制來預防和緩解前列腺癌，同樣需要進一步的探索。

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