張麗虹 古云 楊驊 楊國(guó)偉 馮麗娟

氯氮平（clozapine，CLO）是臨床目前常用的非典型抗精神病藥物 （atypical antipsychotic drug,AAPD）之一，其對(duì)急慢性精神分裂癥均有良好的療效[1-3]。AAPD在臨床應(yīng)用過(guò)程中，脂質(zhì)代謝紊亂是最突出和最棘手的副反應(yīng)之一，其發(fā)生與膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 （sterol regulatory elementbinding proteins,SREBP）信號(hào)通路密切相關(guān)[4-5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，CLO可以促進(jìn)肝細(xì)胞SREBP的表達(dá)，激活下游相關(guān)靶基因和酶，進(jìn)而增加脂肪酸和膽固醇的生物合成[6]。二甲雙胍（metformin，MET）是治療2型糖尿病的一線(xiàn)藥物，可降低糖尿病患者空腹及餐后高血糖[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，MET除具有良好的降糖作用外，還兼有控制體重、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)心血管等作用，其機(jī)制可能與MET抑制膽固醇合成和貯存，從而降低血清甘油三酯和總膽固醇水平相關(guān)[8]。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，考察MET對(duì)CLO所致脂質(zhì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用，探討防治AAPD所致脂質(zhì)代謝紊亂的新策略，同時(shí)為臨床其他原因所致脂質(zhì)代謝紊亂的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物成年雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠 36只，SPF級(jí)，體重200～230 g，由上海斯萊克動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào)：4300470023586。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度 50%～60%，明暗周期 12 h/12 h，正常飲食（3%脂肪，3.2 kcal/g）、飲水。大鼠在單獨(dú)的籠中分開(kāi)飼養(yǎng)，每日記錄大鼠體重和食物攝入量。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及操作均符合動(dòng)物管理?xiàng)l例，遵循“3R”原則。

1.2 動(dòng)物分組與給藥方法大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、CLO組、CLO+MET組、CLO+A769622組等 4組，每組9只。由于CLO在大鼠體內(nèi)半衰期較短，通過(guò)腹腔注射給予，劑量為15 mg/kg[9]，CLO（武漢世吉藥業(yè)有限公司）用0.9%生理鹽水（含0.2%的醋酸和0.5%吐溫80）配制；MET灌胃給藥，劑量為30 mg/kg[9]，MET（Eastbang 制藥公司）用 0.9%生理鹽水配置；AMPK激動(dòng)劑A769662灌胃給藥，劑量為 20 mg/kg[9]，A769622（Sigma 公司）用 1%的DMSO配制。連續(xù)給藥4周，每日根據(jù)大鼠體重調(diào)整給藥劑量。

1.3 檢測(cè)方法給藥第4周末，禁食12 h后處死大鼠，取大鼠軀干血及肝臟中葉組織，血樣離心后和肝臟組織迅速放入液氮中，-80℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.3.1 生化指標(biāo)測(cè)定 血清游離脂肪酸 （free fatty acid synthase,FFAs）和總膽固醇（total cholesterol,TC）采用酶法測(cè)定，按試劑盒（Sekisui Medic，日本）說(shuō)明書(shū)完成測(cè)定，甘油三酯（triglyceride,TG）用TG甘油磷酸氧化酶實(shí)驗(yàn)測(cè)定（Abbott Laboratories，美國(guó)），葡萄糖通過(guò)己糖激酶試劑盒測(cè)定（Abbott Laboratories,美國(guó)）。肝臟中TC和 TG根據(jù)Folch法用氯仿—甲醇（體積比2∶1）混合液提取，然后使用試劑盒測(cè)定（Cayman Chemical，美國(guó)）。

1.3.2 腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化水平檢測(cè) 采用western blot法檢測(cè)腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）磷酸化水平。取大鼠肝臟組織勻漿后提取總蛋白，并用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。取處理后的蛋白樣品50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。分別加入以下抗體，4℃孵育過(guò)夜：Phosphor-AMPK（Thr172）（1∶2000）、AMPK （1∶2000）、β-actin（Proteintech;1∶4000）。β-actin為內(nèi)參，TBST 洗膜3次后顯影。圖像分析用Quantity One（version 4.6）分析軟件。

1.3.3 脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶mRNA檢測(cè) 按照試劑盒（invitrogen，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)用Trizol試劑提取肝臟組織總RNA。采用Real-Time qPCR分析脂肪酸合成關(guān)鍵酶、膽固醇代謝關(guān)鍵酶mRNA的表達(dá)水平，包括1型膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element-binding protein type 1，SREBP1）、乙酰輔酶 A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase 1c，ACC1）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）、SREBP2、羥甲基戊二酰輔酶A合酶 （hydroxymethyl glutaryl coenzyme A synthase,HMGCS）、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶 （hydroxymethyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGCR）、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor,LDLR）。PCR定量在Biorad Cx96檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行（Biorad，美國(guó)），使用SYBR綠色 PCR 工具（Applied Bio-systems,USA），基因引物見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性 15 s，50℃退火 2 min，循環(huán) 40次，60℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物定量用β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。體重和攝食數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，以處理方式為組間因素，時(shí)間為組內(nèi)因素。血清和肝臟中各脂質(zhì)代謝物含量、AMPK磷酸化水平、脂肪酸合成和膽固醇代謝關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)水平組間比較采用單因素方差分析，并用LSD法兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 體重與食物攝取情況對(duì)于大鼠體重，時(shí)間與分組交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.65，P＜0.01），見(jiàn)圖1；對(duì)于食物攝取量，交互效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.91，P=0.41），見(jiàn)圖 2。從第 1周開(kāi)始 CLO 組、CLO+MET組、CLO+A769662組相比對(duì)照組體重都較低（P＜0.05），CLO+MET 組相比 CLO 組、CLO+A769662 組體重較低（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠體重變化。與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表1 real-time qPCR分析使用的引物序列

圖2 各組大鼠攝食量變化

2.2 血清與肝臟中各脂質(zhì)代謝物水平TG（F=57.35，P＜0.01）、FFA（F=10.56，P＜0.01）、TG（F=5.43，P＜0.01）在4組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CLO組、CLO+MET組、CLO+A769662組相比對(duì)照組血清中TG、FFA 水平增加（P＜0.01）；CLO 組（P＜0.01）、CLO+MET組 （P＜0.05）相比對(duì)照組血清中TC水平增加，血清中葡萄糖（glucose）水平相比對(duì)照組無(wú)明 顯 增 加 （P＞0.05）；CLO、CLO+MET、CLO+A769662組相比對(duì)照組肝臟中TG水平增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；CLO 組（P＜0.01）、CLO+A769662組（P＜0.05）相比對(duì)照組肝臟中TC水平增加。見(jiàn)表2。

2.3 AMPK磷酸化水平各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.26，P＜0.01）。 CLO+MET、CLO+A769662 組相比對(duì)照組AMPK磷酸化水平增加 （P＜0.01），而CLO 組相比對(duì)照組、CLO+MET、CLO+A769662組AMPK磷酸化水平減少（P＜0.01）。見(jiàn)圖3與表2。

圖3 western-blot法檢測(cè)各組大鼠AMPK磷酸化水平的電泳圖

2.4 脂肪酸合成關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)水平SREBP1mRNA（F=10.42，P＜0.01）、AAC1mRNA （F=9.83，P＜0.01）、FASmRNA（F=5.43，P＜0.01）組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CLO組相比對(duì)照組、CLO+MET組及CLO+A769662組脂肪酸合成關(guān)鍵酶SREBP1mRNA表達(dá)增加（P＜0.01），同時(shí)其下游ACC1mRNA（P＜0.01）、FASmRNA （P＜0.05） 表達(dá)也增加；CLO+MET、CLO+A769662組相比對(duì)照組SREBP1mRNA和其下游ACC1mRNA 表達(dá)增加 （P＜0.01）；CLO+A769662組相比對(duì)照組、CLO組和CLO+MET組FASmRNA 表達(dá)減少（P＜0.01）。見(jiàn)表 3。

表2各組大鼠血清和肝臟中脂質(zhì)代謝物水平

表3各組大鼠AMPK磷酸化水平、脂肪酸和膽固醇代謝關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)水平

2.5膽固醇代謝關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)水平SREBP2mRNA（F=4.36，P＜0.05）、HMGCRmRNA（F=8.61，P＜0.01）、LDLRmRNA（F=5.17，P＜0.05）各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CLO 組（P＜0.01）、CLO+A769662組 （P＜0.05）相比對(duì)照組膽固醇合成關(guān)鍵酶SREBP2mRNA表達(dá)增加，其下游HMGCSmRNA表達(dá) 增加 無(wú)統(tǒng) 計(jì)學(xué) 意 義 （P＞0.05）；CLO、CLO+MET、CLO+A769662組相比對(duì)照組HMGCRmRNA表達(dá)增加（P＜0.01）；CLO（P＜0.01）、CLO+A769662（P＜0.05）組相比對(duì)照組LDLRmRNA表達(dá)增加。見(jiàn)表3。

3 討論

隨著AAPD的推廣應(yīng)用，精神分裂癥的療效明顯改善，嚴(yán)重的錐體外系副反應(yīng)大大減少，但藥物引起的軀體問(wèn)題如糖尿病、心血管疾病等卻明顯增加，嚴(yán)重影響患者治療的依從性，增加臨床選藥的局限性。而促使發(fā)生這些軀體疾病的危險(xiǎn)因素包括肥胖、血脂障礙、胰島素抵抗、糖代謝紊亂和高血壓等[10-11]。有研究顯示，臨床常用的一些AAPD包括氯氮平、奧氮平、利培酮、喹硫平等，對(duì)機(jī)體代謝有顯著的負(fù)面影響，大大增加首發(fā)精神分裂癥患者代謝綜合征的發(fā)病率[12]?；颊唧w重增加和血脂異常是這些AAPD臨床使用過(guò)程中最突出的代謝副反應(yīng)，也是代謝綜合征的高危因素[13]。研究者普遍認(rèn)為AAPD致脂質(zhì)代謝紊亂的機(jī)制可能與藥物阻斷中樞5-羥色胺2c受體 （5-HT2c）和組胺H1受體，激活下丘腦的腺苷酸活化蛋白激酶，進(jìn)而刺激食欲有關(guān)[14]。然而越來(lái)越多研究也表明，AAPD可以在不影響攝食的情況下對(duì)脂質(zhì)代謝直接產(chǎn)生作用[15]。

本研究結(jié)果顯示CLO可能會(huì)導(dǎo)致大鼠體重降低，其具體機(jī)制尚未明確，可能的原因是CLO引起的代謝紊亂與下丘腦神經(jīng)傳導(dǎo)無(wú)關(guān)，通過(guò)其對(duì)脂肪細(xì)胞功能的直接作用改變外圍脂質(zhì)代謝，而不依賴(lài)于藥物刺激食欲以增加食物攝取，進(jìn)而導(dǎo)致體重增加。這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[15]。

MET和A769622都屬于AMPK激動(dòng)劑，不論是單獨(dú)給予大鼠CLO，還是在給予大鼠CLO的同時(shí)分別給予MET或A769622，結(jié)果都顯示大鼠的體重相比對(duì)照組有所降低，說(shuō)明AMPK的這兩個(gè)激動(dòng)劑均沒(méi)有緩解CLO對(duì)大鼠體重降低的作用。同時(shí)，本研究結(jié)果也顯示CLO和MET均對(duì)大鼠攝食量沒(méi)有明顯影響，說(shuō)明CLO和MET對(duì)脂質(zhì)代謝的干預(yù)可能不是通過(guò)增加攝食間接引起，其機(jī)制可能是直接調(diào)控SREBP[16]。SREBP是膜結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)節(jié)下游一系列靶基因參與脂質(zhì)自穩(wěn)態(tài)的許多方面，是調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)自穩(wěn)態(tài)的“樞紐”。目前，已發(fā)現(xiàn)肝臟有3種SREBP：SREBP-1（包 括 SREBP-1a 和 SREBP-1c），SREBP-2。SREBP-1a主要促進(jìn)脂肪酸的大量合成。機(jī)體通過(guò)SREBP精細(xì)調(diào)節(jié)著脂質(zhì)合成的網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)SREBP過(guò)度表達(dá)時(shí)則可引起循環(huán)系統(tǒng)中膽固醇和甘油三酯增高，以及外周脂質(zhì)蓄積[16]。

本研究結(jié)果顯示CLO和MET對(duì)大鼠脂質(zhì)代謝都有一定影響，可調(diào)節(jié)血清中TG、TC、FFA水平，以及肝臟中TG水平、TC水平。CLO組相比對(duì)照組明顯增加了血清中TC、TG、FFA水平，以及肝臟中TG、TC水平。本研究還發(fā)現(xiàn)，MET及AMPK激動(dòng)劑A769622使AMPK磷酸化水平明顯增加。AMPK被磷酸化后，抑制了SREBP1mRNA及其下游ACC1、FASmRNA的表達(dá)，從而減少脂質(zhì)合成[5]。而CLO則抑制AMPK的磷酸化，其通過(guò)增加SREBP1mRNA及其下游ACC1、FASmRNA的表達(dá)，增加脂質(zhì)合成[17]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，CLO、奧氮平和利培酮可以在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)肝細(xì)胞SREBP表達(dá)，激活下游相關(guān)靶基因和酶，進(jìn)而增加脂肪酸和膽固醇的生物合成；而單劑量氯氮平和奧氮平就可以上調(diào)大鼠SREBP并引起肝臟和脂肪組織中脂質(zhì)蓄積[17-18]。

膽固醇合成關(guān)鍵酶包括SREBP2、HMGCS及LDLR。AMPK激動(dòng)劑MET和A769662都可以激活A(yù)MPK，通過(guò)調(diào)節(jié)膽固醇合成的關(guān)鍵酶，來(lái)影響血清及肝臟中膽固醇水平[19]。本研究發(fā)現(xiàn)CLO明顯增加膽固醇合成關(guān)鍵酶SREBP2mRNA及其下游HMGCSmRNA、LDLRmRNA表達(dá)，進(jìn)而增加血清及肝臟中膽固醇的水平。

因此，通過(guò)誘導(dǎo)肝臟中SREBP的表達(dá)而顯著促進(jìn)脂質(zhì)的生成，是氯氮平等AAPD致脂質(zhì)代謝紊亂的重要機(jī)制之一。與SREBP相關(guān)的病理生理學(xué)改變是導(dǎo)致代謝綜合征中諸如肥胖、血脂紊亂和心血管疾病的關(guān)鍵原因，而通過(guò)抑制SREBP通路來(lái)輔助治療AAPD引起的代謝副反應(yīng)也將有廣闊的應(yīng)用前景，為開(kāi)發(fā)低副反應(yīng)的抗精神分裂癥藥物提供新靶點(diǎn)，同時(shí)為臨床其他原因所致脂質(zhì)代謝紊亂的治療提供重要參考。