湯陳鵬，呂 峰，王蓉琳

(福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002)

鋅是人體必需的微量元素之一，其在人體的生理活動中起著重要的作用。缺鋅會導致食欲不振、免疫力降低、兒童發(fā)育遲緩等癥狀，還容易誘發(fā)冠心病、高血壓、高血糖等疾病[1]，同時男性生殖系統(tǒng)疾病與缺鋅也有著密切的關系[2]。無機補鋅劑，例如硫酸鋅、氧化鋅等，在使用時人體吸收率較低，且對胃腸道刺激較大[3]。文獻資料表明，與無機鋅相比，有機鋅在人體的利用率和生理活性方面有著顯著的優(yōu)勢[4-6]。

孔石莼是我國的一種大型經濟綠藻，屬于綠藻門石莼科石莼屬，多分布于北太平洋的西部、朝鮮、日本以及中國沿海[7]?？资恢泻胸S富的營養(yǎng)與活性成分，如多糖、氨基酸、蛋白質、維生素等[8]，特別是孔石莼多糖含量豐富。大量研究證明，孔石莼多糖具有諸多的生物活性，如降血糖[9]、降血脂[10]、抗腫瘤[11]、抗氧化、抗輻射[12]等，開發(fā)前景廣闊。

多糖的絡合改性指的是多糖與金屬或某些非金屬離子發(fā)生絡合反應，生成絡合物的改性方法。許多研究表明，多糖的絡合改性不僅能顯著提高其本身的生物活性，甚至還可賦予新的功能；此外，經過絡合的金屬更容易被生物體所吸收。絡合改性已然成為多糖改性領域中頗受重視的一類改性方法。通過絡合改性將孔石莼多糖與鋅結合，可以獲得一種兼具多糖生理活性的有機補鋅劑，具有廣闊的研究和應用前景，可為孔石莼資源的高值化利用和新型生物補鋅劑的開發(fā)提供理論依據，而目前尚未有研究對此進行探索。

本研究以孔石莼脫蛋白多糖為原料，采用硫酸鋅與其進行絡合反應，制備了孔石莼多糖鋅絡合物，并采用3因素3水平的Box-Behnken響應面法對其絡合鋅工藝進行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孔石莼粉末：80目，購于福建海興保健食品有限公司。

硫酸鋅、95%乙醇、檸檬酸、鹽酸、碳酸鈉，均為分析純；鹽酸，食品級；硝酸、高氯酸，均為優(yōu)級純；1 000 mg/L鋅標準溶液：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；纖維素酶(200 000 U/g)：寧夏和氏璧生物技術有限公司；堿性蛋白酶(200 000 U/g)：江蘇銳陽生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

BSA223S分析天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；HWS24型恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；SK8210LHC型超聲清洗器：上?？茖С晝x器有限公司；RE52-99型旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DL-5-B離心機：上海安亭科學儀器廠；PHB-3 pH計：上海三信儀表廠；FreeZone 6L落地式凍干機：美國LABCONCO公司；AA-6300C原子吸收分光光度計：日本島津儀器設備公司。

1.3 試驗內容與方法

1.3.1 孔石莼脫蛋白多糖的制備

孔石莼粉末→以料液比1∶30(g/mL)加蒸餾水→使用檸檬酸調節(jié)pH=4.8→按每g孔石莼粉末加入400 U已活化的纖維素酶→ 45℃超聲提取90 min→煮沸滅酶10 min→200目絹布過濾→ 4 000 rpm離心10 min→收集上清液→真空濃縮→冷藏醇沉過夜→離心、收集固體→加水溶解→真空濃縮→冷凍干燥→孔石莼多糖粗品。

孔石莼多糖粗品→料液比1∶100(g/mL)加蒸餾水→使用碳酸鈉調節(jié)pH=10.5→按每g孔石莼多糖粗品加入1 400 U已活化的堿性蛋白酶→55℃酶解2.0 h→煮沸滅酶10 min→4 000 rpm離心10 min→收集上清液→調pH至中性→ 7 000 Da透析袋透析36～48 h→真空濃縮→冷凍干燥→孔石莼脫蛋白多糖(多糖含量53%)。

1.3.2 孔石莼多糖絡合鋅工藝流程

孔石莼脫蛋白多糖→配制成一定濃度的溶液→按既定質量比加入硫酸鋅溶液→調節(jié)pH→恒溫水浴反應90 min→反應液透析除去未發(fā)生絡合反應的Zn2+→真空濃縮→冷凍干燥→孔石莼多糖鋅絡合物。

1.3.3 Box-Behnken響應面法優(yōu)化孔石莼多糖絡合鋅工藝

基于前期探索性試驗，設反應體系的Zn2+濃度3.00 mg/mL、反應時間90 min，以反應溫度(X1)、反應體系pH(X2)、孔石莼多糖與Zn2+質量比(X3)為自變量，孔石莼多糖鋅絡合物鋅含量(Y)為響應值，采用3因素3水平的Box-Behnken響應面法優(yōu)化孔石莼多糖絡合鋅工藝。3因素3水平的Box-Behnken響應面試驗設計的因素水平編碼表見表1。

表1 Box-Behnken響應面因素水平編碼表

1.4 指標檢測與方法

1.4.1 Zn2+標準曲線制作

依照國標GB 5009.14—2017 《食品安全國家標準 食品中鋅的測定》[13]的方法，準確吸取鋅標準儲備液(1000 mg/L)1.00 mL于100 mL容量瓶中，加入3.3%硝酸溶液定容，混勻，配成10 mg/L的鋅標準中間液。分別準確吸取鋅標準中間液 0.00、1.00、2.00、4.00、 8.00和10.00于100 mL容量瓶中，加入3.3%硝酸溶液定容，混勻，制備成質量濃度分別為 0.000、0.100、0.200、0.400、0.800和1.000 mg/L的系列鋅標準溶液，在火焰原子吸收分光光度計中測定其吸光度，得到Zn2+標準曲線。

1.4.2 孔石莼多糖鋅絡合物鋅含量的測定

參照國標GB 5009.14—2017《食品安全國家標準 食品中鋅的測定》[13]，稱取孔石莼多糖鋅絡合物0.1 g放入消解罐中，加入濃硝酸、高氯酸進行消解，消解產物稀釋定容，測定吸光度，帶入回歸方程(1)計算Zn2+濃度，鋅含量Q計算公式如下：

Q=cVD/1 000m

(1)

式中：Q為鋅含量(mg/g)；c為待測液Zn2+濃度(μg/mL)；V為消解產物定容體積(mL)；D為稀釋倍數(shù)；m為孔石莼多糖鋅絡合物質量(g)。

2 結果與分析

2.1 Zn2+標準曲線的建立

Zn2+的回歸方程為：

y=0.470 02x+0.028 690，R2=0.999 6

(2)

式中：x為待測液Zn2+濃度(μg/mL)；y為吸光度。

2.2 回歸方程的建立與方差分析

采用 Design Expert 8.0.5統(tǒng)計分析軟件對表2數(shù)據進行處理，建立反應溫度(X1)、反應體系pH(X2)、孔石莼多糖與Zn2+質量比(X3)3個因素與響應值孔石莼多糖鋅絡合物鋅含量(Y)的回歸方程為：

Y=101.72+0.76X1-0.83X2-1.72X3-1.32X1X2-0.43X1X3+1.18X2X3-3.28X12-3.49X22-6.33X32

(3)

為驗證回歸方程(3)的有效性，對其進行方差分析，結果見表3。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果(n=3)

表3 孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量方差分析表

注：*表示顯著(P<0.05)，**表示極顯著(P<0.01)。

Notes：*indicated significant difference(P<0.05)；**indicated extremely significant difference(P<0.01).

2.3 單因素對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量影響效應分析

對回歸方程(3)進行降維分析，將反應溫度(X1)、反應體系pH(X2)、孔石莼多糖與Zn2+質量比(X3)三因素的其中兩個因素固定為零水平，考察各單因素在不同水平上對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量(Y)的影響，并得到以其中一個因素為決策變量的偏子回歸模型，使用Excel軟件繪圖得到各因素對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量(Y)影響的曲線，結果見圖1。

結合圖1與表3可知，三因素對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量Y影響的顯著性大小依次為孔石莼多糖與Zn2+質量比(X3)>反應體系pH值(X2)>反應溫度(X1)。固定其他兩個因素為零水平時，鋅含量(Y)均隨各因素水平的提高先增加后減少。當反應溫度X1水平為0.12(即50.60℃)，反應體系pH值X2水平為-0.12(即4.94)，而孔石莼多糖與Zn2+質量比X3水平為-0.14(即2.86∶1)時，孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量均可分別達到最大值，依次分別為101.76 mg/g、101.77 mg/g、101.84 mg/g。

2.4 試驗因素間交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量影響效應分析

根據表3的方差分析結果可知，試驗因素間交互項對孔石莼多糖鋅絡合物鋅含量Y有顯著影響(P<0.05)的是X2X3(即反應體系pH值和孔石莼多糖與Zn2+質量比)，有極顯著(P<0.01)影響的是X1X2(即反應溫度與反應體系pH值)，本研究即對此二項進行分析，結果見圖2、圖3、表3。

2.4.1 反應溫度與反應體系pH的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量的影響

圖2中(a)等高線呈橢圓形，說明反應溫度X1與反應體系pHX2的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量有極顯著影響(P<0.01)；從圖2(b)響應面圖可以看出，當孔石莼多糖與Zn2+質量比X3固定為零水平(即3∶1)時，反應溫度X1在45.0～50.7℃范圍內，反應體系pHX2在4.50～4.93范圍內，兩因素的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量Y的影響呈正相關關系，即鋅含量Y隨兩因素水平上升而增加；而當反應溫度X1>50.7℃、反應體系pHX2>4.93的范圍內，兩因素的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量Y的影響呈負相關關系，即鋅含量隨兩因素水平上升而呈下降趨勢。從圖2(a)中還可看出，反應體系pHX2軸向等高線分布較密集，說明在本研究的絡合反應過程中，反應體系pHX2對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量的影響較反應溫度X1顯著。

反應溫度的適度上升可以加劇體系中反應分子的運動，促進孔石莼多糖與Zn2+的絡合，而反應體系pH的適當提高可以降低體系中H+的濃度，減小其與金屬離子競爭絡合的程度[14]，從而提高產物的鋅含量，因此在一定范圍內，當反應溫度和反應體系pH同時上升時，兩者效應的疊加可以大幅度提高孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量；但是由于絡合反應本身是一個放熱反應，若溫度過高時，Zn2+運動過快，與多糖的絡合會變得困難，且已形成的絡合物穩(wěn)定性也會減弱[15]； 而pH過高時，反應體系中游離的Zn2+容易生成Zn(OH)2，導致游離Zn2+濃度明顯降低，亦影響絡合效果。綜上，若當二因素水平均偏低或過高時，兩者的交互作用均不利于孔石莼多糖對Zn2+的絡合作用。

2.4.2 反應體系pH和孔石莼多糖與Zn2+質量比的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量的影響

結合表3與圖3(a)可知，反應體系pHX2和孔石莼多糖與Zn2+質量比X3的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量的影響顯著(P<0.05)，且孔石莼多糖與Zn2+質量比X3對鋅含量的影響較反應體系pHX2顯著。圖3(b)顯示，當反應溫度X1固定為零水平(50℃)時，反應體系pHX2在4.50～4.93范圍內，孔石莼多糖與Zn2+質量比X3在2.0∶1～2.8∶1范圍內，二者的交互作用對鋅含量Y的影響呈正相關關系；而當反應體系pHX2>4.93、孔石莼多糖與Zn2+質量比>2.8∶1的范圍內，二者的的交互作用對鋅含量Y的影響呈負相關關系。

多糖與金屬離子質量比的適當增加，不僅促進二者的絡合，提高反應進行程度，還可以提高絡合物的穩(wěn)定性[16]；而反應體系pH的適當提高可以降低體系中H+與金屬離子競爭絡合多糖，以確保多糖對金屬離子的絡合，因此在一定范圍內，當反應體系pH和孔石莼多糖與Zn2+質量比同時上升時，兩者作用的協(xié)同效應極大地提高了產物的鋅含量。反之，若反應體系pH過高，且孔石莼多糖與Zn2+的質量比過大時，一方面反應體系的Zn2+容易生成Zn(OH)2，使體系中游離Zn2+濃度大幅降低，另一方面孔石莼多糖含量過高，反應體系的粘度變大，阻礙分子運動，兩種作用均可明顯影響絡合效果。綜上，當兩因素值均過高時，兩者的交互作用將顯著地降低孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量。

2.5 工藝優(yōu)化與驗證試驗

使用Design Expert 8.0.5對回歸方程(3)求解，計算得出孔石莼多糖絡合Zn2+的最佳工藝條件組合為反應溫度50.8℃、pH 4.91、孔石莼多糖與Zn2+質量比2.8∶1，得到孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量的預測值為101.99 mg/g(注：該預測值略低于響應面試驗中若干組實際值，其可能是試驗誤差所致)。為提高實際操作的便利性，將試驗條件校正為反應溫度50℃、pH 5.0、孔石莼多糖與Zn2+質量比2.8∶1，同時控制反應體系中的Zn2+濃度為3.00 mg/mL、反應時間90 min，進行擴大性驗證試驗，平行重復3次，所得孔石莼多糖鋅絡合物中鋅含量為(102.41±0.67)mg/g，與理論預測值(101.99 mg/g)相對誤差為0.41%，沒有顯著性差異，說明預測值與實際值擬合性較好，響應面得到的絡合工藝參數(shù)準確可靠，在實際生產中可行。

3 結論

本研究基于前期探索性試驗，在控制反應體系中的Zn2+濃度為3.00 mg/mL、反應時間90 min的前提下，采用Box-Behnken響應面試驗設計優(yōu)化孔石莼多糖絡合鋅反應的主要工藝參數(shù)，建立了反應溫度(X1)、反應體系pH(X2)、孔石莼多糖與Zn2+質量比(X3)3個因素與響應值孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量(Y)的回歸方程為：

Y=101.72+0.76X1-0.83X2-1.72X3-1.32X1X2-0.43X1X3+1.18X2X3-3.28X12-3.49X22-6.33X32

通過對回歸方程的方差分析可知，孔石莼多糖與Zn2+的質量比、反應溫度與反應體系pH的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量影響極顯著(P<0.01)；反應溫度、反應體系pH和孔石莼多糖與Zn2+質量比的交互作用對孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量影響顯著(P<0.05)。經過計算和校正，獲得孔石莼多糖絡合鋅的最佳工藝參數(shù)組合為孔石莼多糖與Zn2+質量比2.8∶1、反應溫度50℃、反應體系pH 5.0，以此條件下進行絡合的效果理想，孔石莼多糖鋅絡合物的鋅含量為(102.41±0.67)mg/g，與預測值101.99 mg/g之間的差異不顯著(P>0.05)。

綜上說明，該響應面模型與實際數(shù)據擬合性較好，可以很好地適用于孔石莼多糖絡合鋅工藝的優(yōu)化。