李志輝，楊志強(qiáng)*，李瀟軒，陳建清，朱 天，韓 飛，張翠林

(1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017； 2.南京亞琦錦鯉有限公司，江蘇 南京 210000 )

維生素C是魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，作為重要的機(jī)體生理代謝調(diào)節(jié)因子，在魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育、抗應(yīng)激、免疫等方面發(fā)揮作用。多數(shù)魚(yú)類(lèi)體內(nèi)因缺乏L-2古洛內(nèi)酯氧化酶而不能自主合成維生素C，因此必須從食物中攝取，進(jìn)而滿足自身生長(zhǎng)發(fā)育的需求[1-3]。魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中若長(zhǎng)期缺乏維生素C，將導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)出現(xiàn)厭食、肌肉組織出血、眼球突出、游動(dòng)異常、骨質(zhì)畸形、骨膠原減少等維生素C缺乏癥狀，并減緩其生長(zhǎng)發(fā)育[4-5]。尤其是在高密度養(yǎng)殖條件下，在飼料中添加適量的維生素C可以減緩應(yīng)激反應(yīng)，提升魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)速度和機(jī)體免疫能力[6]。

錦鯉(Cyprinuscarpio)作為我國(guó)重要的觀賞魚(yú)養(yǎng)殖品種之一，因其體型優(yōu)美、色彩艷麗、花紋多樣、游姿健碩，故譽(yù)之為 “會(huì)游泳的藝術(shù)品”[7]。對(duì)有關(guān)錦鯉營(yíng)養(yǎng)及飼料需求的研究，主要集中在蛋白質(zhì)、脂肪、增色劑等成分對(duì)錦鯉的生長(zhǎng)和體色的影響[8-10]。然而有關(guān)維生素C對(duì)錦鯉生長(zhǎng)和非特異性免疫的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。水生動(dòng)物對(duì)維生素C的需求及穩(wěn)定性處理一直是水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。因此，本試驗(yàn)選擇維生素C磷酸酯作為維生素C源，研究飼料中添加不同劑量的維生素C對(duì)錦鯉生長(zhǎng)性能、非特異性免疫及其組織中維生素C含量的影響，以期為維生素C在錦鯉飼料中的研發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料與制備

參照孟素宣等研發(fā)的錦鯉飼料配方配制試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料[11]，基礎(chǔ)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)如表1所示。以維生素C磷酸酯(維生素C有效含量為35%)作為飼料維生素C添加源，分別設(shè)置0、20、40、80、160、320 mg/kg等 6個(gè)維生素C添加水平，并分別配制成6組等氮等脂的試驗(yàn)飼料。

表1 基礎(chǔ)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理

試驗(yàn)錦鯉選自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所祿口基地繁育的同一批錦鯉苗種。挑選健康活潑、規(guī)格一致的錦鯉苗種于室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖池中，投喂基礎(chǔ)飼料馴化10 d后，選擇大小一致、體質(zhì)量(10.21±0.02)g的錦鯉，隨機(jī)分為6組，每組40尾錦鯉，并且每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每組分別投喂含有不同維生素C含量的配制飼料，投喂未添加維生素C的基礎(chǔ)飼料處理組為對(duì)照組，投喂添加維生素C飼料的處理組為試驗(yàn)組。試驗(yàn)在室內(nèi)循環(huán)水泥池(體積400 L)中進(jìn)行，飼養(yǎng)60 d。

養(yǎng)殖用水為曝氣后的自來(lái)水，試驗(yàn)期間水溫(26.3±2.5)℃，pH(7.6±0.3)，溶氧量>5.2 mg/L，氨氮含量<0.5 mg/L。每天早晚(08∶00、18∶00)各投喂1次，日投喂量占魚(yú)總體質(zhì)量的5%，每天根據(jù)錦鯉攝食、活動(dòng)水平適當(dāng)調(diào)整投喂量，并記錄錦鯉死亡數(shù)。

1.3 樣品的采集

試驗(yàn)結(jié)束，經(jīng)饑餓處理24 h后再稱(chēng)取每組魚(yú)體質(zhì)量。每組隨機(jī)抽取5尾錦鯉進(jìn)行靜脈取血，使用冷凍離心機(jī)于4℃條件下6 000 r/min離心10 min，收集血清于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∑浼∪夂透闻K組織，并迅速置于-20℃保存，備用。

1.4 樣品測(cè)定

1.4.1 組織中維生素C含量

錦鯉肌肉和肝臟中維生素C的含量測(cè)定采用2，4-二硝基苯肼法。

1.4.2 免疫指標(biāo)

非特異性免疫測(cè)定指標(biāo)主要包括溶菌酶(LZM)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)，酶活性測(cè)定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.5 計(jì)算公式

增重率(WGR)=(末體質(zhì)量—初始體質(zhì)量)/初始體質(zhì)量×100%

特定生長(zhǎng)(SGR)=(ln末體質(zhì)量—ln初始體質(zhì)量)/天數(shù)×100%

成活率(SR)=試驗(yàn)結(jié)束魚(yú)尾數(shù)/試驗(yàn)初始魚(yú)尾數(shù)×100%

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的方法表示，并采用 SPSS 16.0 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 飼料中不同水平維生素C對(duì)錦鯉生長(zhǎng)性能的影響

飼料中不同水平維生素C對(duì)錦鯉生長(zhǎng)性能的影響見(jiàn)表2。試驗(yàn)組錦鯉的特定生長(zhǎng)率增重率及成活率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；試驗(yàn)組錦鯉特定生長(zhǎng)率和成活率隨維生素C添加量的增加呈上升趨勢(shì)，但試驗(yàn)組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，錦鯉增重率則先升高后趨于平穩(wěn)(P<0.05)。

表2 飼料中不同水平維生素C對(duì)錦鯉生長(zhǎng)性能的影響

注：同行數(shù)據(jù)肩注不同小寫(xiě)字母表示差異性顯著(P<0.05)。下表同。

Notes：In the same row，values with different small letter superscripts meant significant difference(P<0.05).The same as below.

2.2 飼料中不同水平維生素C對(duì)肌肉和肝臟中維生素C含量的影響

飼料中不同水平維生素C對(duì)錦鯉肌肉和肝臟中維生素C含量的影響見(jiàn)表3。飼料中添加維生素C對(duì)錦鯉肌肉和肝臟中維生素C含量均有顯著影響(P<0.05)，且隨著維生素C添加量的升高，肌肉和肝臟中維生素C含量均呈先升高后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，肝臟的維生素C含量顯著高于肌肉(P<0.05)。

表3 飼料中不同水平維生素C對(duì)錦鯉肌肉及肝臟維生素C含量的影響

2.3 飼料中不同水平維生素C對(duì)錦鯉非特異性免疫指標(biāo)的影響

飼料中不同水平維生素C對(duì)錦鯉非特異性免疫指標(biāo)的影響見(jiàn)表4。飼料中添加維生素C對(duì)血清LZM沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。20 mg/kg試驗(yàn)組錦鯉血清SOD、CAT和AKP酶活性與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；80、160、320 mg/kg試驗(yàn)組錦鯉血清SOD、CAT和AKP酶活性均顯著高于對(duì)照組和20 mg/kg試驗(yàn)組(P<0.05)。

表4 飼料中不同水平維生素C對(duì)錦鯉非特異性免疫指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 飼料中添加維生素C對(duì)錦鯉生長(zhǎng)性能的影響

維生素C作為維持魚(yú)類(lèi)正常生理功能的重要營(yíng)養(yǎng)成分之一，在魚(yú)類(lèi)飼料的研發(fā)應(yīng)用中受到廣泛關(guān)注。本試驗(yàn)結(jié)果表明，維生素C對(duì)錦鯉的增重率影響顯著，試驗(yàn)組錦鯉的特定生長(zhǎng)率和成活率顯著高于對(duì)照組，但試驗(yàn)組之間沒(méi)有顯著差異。陳建明等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加維生素C對(duì)翹嘴鲌魚(yú)種的增重率具有顯著影響，而添加維生素C組之間的成活率沒(méi)有顯著性差異，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)以特定生長(zhǎng)率和增重率為參考指標(biāo)，錦鯉在飼料維生素C含量160 mg/kg條件下生長(zhǎng)最快，推測(cè)錦鯉對(duì)維生素C的需求量約為160 mg/kg。研究表明，羅非魚(yú)(Oreochromisspp)[13]、鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)[14]、斑點(diǎn)叉尾魚(yú)回(Ictaluruspunctatus)[15]、軍曹魚(yú)(Rachycentroncanadum)[16]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[17]對(duì)維生素C的需求量分別為150、45、50、70、150 mg/kg。本試驗(yàn)錦鯉對(duì)維生素C的需求量高于鯉魚(yú)、斑點(diǎn)叉尾魚(yú)回、軍曹魚(yú)等魚(yú)類(lèi)，而與羅非魚(yú)、團(tuán)頭魴等魚(yú)類(lèi)接近，說(shuō)明不同魚(yú)類(lèi)在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)維生素C的需求量存在較大差異，這可能是由于研究者使用的維生素C源、魚(yú)的種類(lèi)、魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)階段及養(yǎng)殖環(huán)境的不同所導(dǎo)致。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)飼料中維生素C的添加量達(dá)到一定水平后，繼續(xù)加大添加量，魚(yú)的生長(zhǎng)速度則保持相對(duì)穩(wěn)定[18]。本試驗(yàn)中當(dāng)飼料中維生素C添加量高于80 mg/kg后，錦鯉增重率增長(zhǎng)幅度趨于零。

3.2 飼料中添加維生素C對(duì)肌肉和肝臟維生素C含量的影響

飼料中維生素C的添加量直接影響?hù)~(yú)體組織中維生素C的積累，且不同組織對(duì)維生素C的積累量存在一定的差異[19-20]。研究表明，維生素C在魚(yú)體組織中積累量由高到低的順序?yàn)槁?、肝臟、肌肉[21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，肝臟和肌肉組織中維生素C含量隨飼料中維生素C添加量的增加先升高后趨于平穩(wěn)，肝臟組織的維生素C的積累量高于肌肉組織，這與前人研究結(jié)果類(lèi)似。本試驗(yàn)中，當(dāng)飼料維生素C添加量高于160 mg/kg時(shí)，錦鯉肝臟和肌肉組織積累維生素C含量趨于平穩(wěn)，表明魚(yú)體各組織對(duì)維生素C的積累能力是有限的，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定限度后，機(jī)體會(huì)降低維生素C的吸收速率[22]。大量研究證明，肝臟維生素C的含量是推算魚(yú)類(lèi)對(duì)維生素C需求量最可靠的指標(biāo)。本試驗(yàn)中錦鯉肝臟維生素C在160 mg/kg時(shí)達(dá)到飽和狀態(tài)，進(jìn)一步推測(cè)錦鯉對(duì)維生素C的需求量約為160 mg/kg。

3.3 飼料中添加維生素C對(duì)錦鯉非特異性免疫指標(biāo)的影響

錦鯉作為較低等的脊椎動(dòng)物，其特異性免疫機(jī)制尚不完善，而非特異性免疫機(jī)制作為第一道防御體系，在防御外來(lái)病原體過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[23-24]。研究表明，維生素C作為一種免疫增強(qiáng)劑，主要是通過(guò)清除細(xì)胞液中自由基、阻礙脂肪酸的過(guò)氧化及抑制組氨酸脫羧酶的活性等方式來(lái)提高魚(yú)類(lèi)機(jī)體免疫能力[25]。SOD在機(jī)體的作用是將活性氧轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，CAT再將過(guò)氧化氫分解為水，從而消除機(jī)體內(nèi)多余的活性氧，發(fā)揮其抗氧化能力，避免脂質(zhì)過(guò)氧化造成細(xì)胞損傷。與黃顙魚(yú)[26]類(lèi)似，本試驗(yàn)錦鯉血液中SOD、CAT、AKP酶活性隨飼料中維生素C添加量的增加先升高后趨于平穩(wěn)，表明維生素C可一定程度上提高抗氧化能力。LZM作為吞噬細(xì)胞的一種堿性蛋白，主要是通過(guò)降解細(xì)胞壁中的黏多糖，達(dá)到消炎、抗菌的目的；AKP作為機(jī)體非特異性免疫因子之一，主要通過(guò)降解酸酯類(lèi)物質(zhì)來(lái)破壞病原體結(jié)構(gòu)，從而消滅病原體，起到自我保護(hù)[27]作用。秦啟偉等[28]研究顯示，維生素C能夠顯著提升石斑魚(yú)(E.awoara)機(jī)體LZM酶活性。本試驗(yàn)中，隨飼料中維生素C添加量的增加，LZM和AKP酶活性均具有隨之升高的趨勢(shì)，但對(duì)LZM酶活性影響不顯著，表明維生素C可一定程度上增強(qiáng)錦鯉機(jī)體非特異性免疫能力。由此可見(jiàn)，飼料中添加維生素C可增強(qiáng)錦鯉機(jī)體非特異性免疫能力，這可能是提高錦鯉生長(zhǎng)性能和成活率的原因之一。

4 結(jié)論

飼料中添加維生素C 可提高錦鯉生長(zhǎng)性能和非特異性免疫能力，建議錦鯉飼料中維生素C添加量控制在160 mg/kg左右為宜。