鄭曉葉，鄭天倫，曹飛飛，朱凝瑜，丁理法，王國良

(1.浙江省水產技術推廣總站，浙江 杭州 310023； 2.溫嶺市水產技術推廣站，浙江 臺州 317500； 3.寧波大學 海洋科學學院 應用海洋生物技術教育部重點實驗室，浙江 寧波 315211)

青蛤(Cyclinasinensis)隸屬瓣鰓綱(Lamellibranchia)簾蛤科(Veneridae)環(huán)文蛤屬(Cyclina)，為濾食性底棲貝類。隨著青蛤規(guī)?；斯び缂夹g的突破[1]，我國江蘇、浙江、遼寧等地沿海青蛤規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)得到迅猛發(fā)展[2]。隨著養(yǎng)殖歷史的延長、養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴大和養(yǎng)殖密度的加大，養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化，致使青蛤病害問題也開始頻繁發(fā)生。通州[3]、連云港[4]、溫州[5]、溫嶺等地青蛤均出現(xiàn)了大規(guī)模死亡的現(xiàn)象，不僅給養(yǎng)殖戶造成大量的經濟損失，也阻礙了青蛤養(yǎng)殖產業(yè)的健康有序發(fā)展。

在養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境中，異養(yǎng)細菌具有重要地位和作用，與養(yǎng)殖生物生長的關系極為密切，是海水養(yǎng)殖環(huán)境研究中不可缺少的重要內容，是正確評價海水養(yǎng)殖生態(tài)結構與功能的重要因素[6-8]，大多數(shù)病原菌為異養(yǎng)細菌[9]。弧菌在水產養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中是一類重要的條件致病菌[9]，研究弧菌數(shù)量的變動旨在監(jiān)測水體中有害菌群的變動規(guī)律，對養(yǎng)殖生產做出指導。養(yǎng)殖環(huán)境中的各種理化因子之間的相互作用，將影響?zhàn)B殖生物的生長與繁殖，青蛤營埋棲生活，池塘水質和底質狀況對其生長都極為重要。由于養(yǎng)殖池塘環(huán)境的自身特點，其生態(tài)平衡和結構與功能的完善通常需要依靠人工調節(jié)[10]。異養(yǎng)細菌數(shù)量變化可間接反映池塘環(huán)境理化因子的變化趨勢，因此，養(yǎng)殖生產中實時監(jiān)測異養(yǎng)細菌的數(shù)量變化，有利于池塘環(huán)境生態(tài)平衡的有效調控。國內外研究者利用傳統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)技術結合現(xiàn)代分子生物學方法對南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)[11-12]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[13-15]、九孔鮑(Haliotisdiversicolorsupertexta)[16]、海參(Apostichopusjaponicus)[17-18]、牡蠣(Crassostreahongkongensis)[19]等海水養(yǎng)殖動物及其養(yǎng)殖水體、養(yǎng)殖區(qū)沉積物中細菌及理化因子都有較多研究，而青蛤養(yǎng)殖環(huán)境異養(yǎng)細菌數(shù)量變化的研究尚未見報道。

本文以浙江省溫嶺市青蛤海水圍塘養(yǎng)殖為對象，研究養(yǎng)殖塘水體、底泥及青蛤腔液中異養(yǎng)細菌和弧菌在不同季節(jié)的數(shù)量變化，為青蛤的健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣圍塘

實驗樣品采集于浙江省溫嶺市龍王青蛤養(yǎng)殖場，選取池塘條件相同的6個不同放養(yǎng)密度、面積約13 340 m2的養(yǎng)殖圍塘，密度梯度設置如下：4×104、6.2×104、8×104、1.57×105、1.64×105、2×105粒·667m-2，依次編號為1、2、3、4、5、6，每個密度組設1個試驗塘，放養(yǎng)稚貝規(guī)格為60～320粒·kg-1。

1.2 樣品采集與處理

采樣周期為5月至12月，每月初采集一次共采樣8次。樣品均放置于保溫冰盒中帶回實驗室。

1.2.1 水樣

用采水器采集20～40 cm深度的水樣500 mL，置于樣品瓶中帶回。取1 mL水樣置于滅菌試管中加入滅菌海水9 mL進行梯度稀釋。

1.2.2 泥樣

取底泥20 g左右置于一次性無菌培養(yǎng)皿中，以封口膜固定培養(yǎng)皿帶回。稱取1 g底泥置于無菌離心管中，加入9 mL滅菌海水，梯度稀釋。

1.2.3 青蛤

每個養(yǎng)殖塘選取3個采樣點隨機采集不少于20枚青蛤置于一次性無菌樣品袋中帶回。從每個樣品袋中隨機取青蛤10枚，取腔液置于滅菌離心管中，用滅菌海水梯度稀釋。

1.3 細菌數(shù)量的測定

1.3.1 異養(yǎng)細菌總數(shù)

取0.2 mL梯度稀釋樣品置于無菌培養(yǎng)皿，倒入適量50%海水配制的普通營養(yǎng)瓊脂，每個稀釋梯度做2個重復，待培養(yǎng)基冷卻凝固后倒置于28 ℃下培養(yǎng)48 h。取菌落數(shù)在30至300的平板進行有效計數(shù)，分別計算水樣、泥樣和青蛤腔液中的異養(yǎng)細菌總數(shù)。

1.3.2 弧菌數(shù)量

取0.2 mL梯度稀釋樣品置于無菌培養(yǎng)皿中，倒入適量TCBS培養(yǎng)基，每個稀釋梯度做2個重復，待培養(yǎng)基冷卻凝固后倒置于28 ℃下培養(yǎng)48 h，取菌落數(shù)在30至300的平板進行有效計數(shù)，分別計算水樣、泥樣和青蛤腔液中的弧菌總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件整理，運用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。各塘或樣品之間的差異性采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，當P<0.05時差異性水平達到顯著，當P<0.01時差異極顯著。相關性用Pearson相關系數(shù)表示，當P<0.05時相關性顯著，當P<0.01時相關性極顯著。圖表繪制使用Origin 8.0完成。

2 結果與分析

2.1 水體中異養(yǎng)細菌數(shù)量和弧菌數(shù)量變動

如圖1-A所示，采樣周期中各養(yǎng)殖塘水體中異養(yǎng)細菌數(shù)量呈現(xiàn)不同的變化趨勢，但是放養(yǎng)密度相近的池塘呈現(xiàn)相似的變化趨勢，如1塘和2塘變化趨勢一致，5月至9月逐漸增大，9月至12月逐漸減少。水體中異養(yǎng)細菌總數(shù)的變化范圍為(2.5×102～5.6×105)cfu·mL-1，1塘數(shù)量最高，平均為8.8×104cfu·mL-1，3塘最低，平均為6.8×103cfu·mL-1。采樣期間，3和4塘異養(yǎng)細菌數(shù)量變化范圍不大，其余4個塘雖存在較大波動，但單因素方差分析顯示，異養(yǎng)細菌隨時間的數(shù)量變化的差異性不顯著(F=1.257，P>0.05)；從空間上看，各養(yǎng)殖塘水體中異養(yǎng)細菌數(shù)量變化的差異性不顯著(F=0.707，P>0.05)。

由圖1-B得知，各養(yǎng)殖塘水體中弧菌數(shù)量呈現(xiàn)較為一致的變化趨勢，2塘數(shù)量最高，平均為1.3×103cfu·mL-1，6塘最低，平均為2.7×102cfu·mL-1。整個采樣周期中，單因素方差分析顯示，各養(yǎng)殖塘水體中弧菌隨時間的數(shù)量變化的差異性顯著(F=2.673，P<0.05)，9月份水樣中弧菌數(shù)量與其他月份有顯著差異；從空間上看，各個養(yǎng)殖塘水體中弧菌數(shù)量變化差異不顯著(F=0.750，P>0.05)。

2.2 底泥中異養(yǎng)細菌和弧菌數(shù)量變動

各養(yǎng)殖塘底泥中異養(yǎng)細菌總數(shù)的變化如圖2-A所示，變化范圍1.3×103～1.3×105cfu·g-1，1塘和5塘變化較大。采樣期間1塘異養(yǎng)細菌數(shù)量最高，平均為4.3×104cfu·g-1，3塘最低，平均為1.1×104cfu·g-1；但單因素方差分析顯示，各塘異養(yǎng)細菌總數(shù)隨時間的數(shù)量變化的差異不顯著(F=0.763，P>0.05)；從空間上看，各養(yǎng)殖塘底泥中異養(yǎng)細菌總數(shù)變化差異不顯著(F=1.954，P>0.05)。

圖1 不同月份各養(yǎng)殖塘水體中異養(yǎng)細菌(A)和弧菌(B)數(shù)量的變化Fig.1 The change trend of total heterotrophic bacteria (A) and the Vibrio number (B) in water for all ponds

各養(yǎng)殖塘底泥中弧菌數(shù)量變化如圖2-B所示，變化范圍為0～9.9×103cfu·g-1，5塘弧菌數(shù)量最高，平均為2.6×103cfu·g-1，1塘最低，平均為75 cfu·g-1。采樣期間各塘底泥中弧菌數(shù)量處于較低水平(0～8.5×102cfu·g-1)，而4塘12月份弧菌數(shù)量達到1.7×103cfu·g-1，5塘11月份和12月份弧菌數(shù)量超過9.0×103cfu·g-1。從時間上看，整個采樣周期中各養(yǎng)殖塘底泥中弧菌數(shù)量變化的差異不顯著(F=0.994，P>0.05)；從空間上看，各養(yǎng)殖塘底泥中弧菌數(shù)量變化差異顯著(F=2.605，P<0.05)，5塘與其他養(yǎng)殖塘底泥中弧菌數(shù)量變化差異顯著。

2.3 同一池塘水體和底泥中異養(yǎng)細菌和弧菌數(shù)量變動

同一養(yǎng)殖塘水體中異養(yǎng)細菌總數(shù)(WT)和弧菌數(shù)(WV)及底泥中的異養(yǎng)細菌總數(shù)(ST)和弧菌數(shù)(SV)變化如圖3所示。各養(yǎng)殖塘水樣異養(yǎng)細菌總數(shù)和弧菌數(shù)量變化趨勢較為一致，Pearson相關性分析顯示養(yǎng)殖密度與水樣中異養(yǎng)細菌總數(shù)和弧菌數(shù)量的變化均呈不顯著負相關，異養(yǎng)細菌數(shù)量變化與養(yǎng)殖密度相關性為(r=-0.024，P>0.05)，弧菌數(shù)量變化與養(yǎng)殖密度相關性為(r=-0.126，P>0.05)，水樣中異養(yǎng)細菌總數(shù)與弧菌數(shù)量變化呈顯著正相關(r=0.335，P<0.05)；各養(yǎng)殖塘底泥中異養(yǎng)細菌總數(shù)和弧菌數(shù)量變化趨勢基本一致，Pearson相關性分析顯示，底泥中異養(yǎng)細菌總數(shù)變化與弧菌數(shù)量變化呈極顯著正相關(r=0.587，P<0.01)；異養(yǎng)細菌總數(shù)與養(yǎng)殖密度呈負相關(r=-0.116，P>0.05)，弧菌數(shù)量變化與養(yǎng)殖密度呈正相關(r=0.181，P>0.05)，底泥中異養(yǎng)細菌數(shù)量變化與水體中異養(yǎng)細菌數(shù)量變化呈正相關(r=0.015，P>0.05)，但相關性均不顯著。

2.4 青蛤腔液中異養(yǎng)細菌和弧菌數(shù)量變化

圖4-A所示，各養(yǎng)殖塘青蛤腔液中異養(yǎng)細菌總數(shù)變化范圍為95～5.9×104cfu·mL-1，最大值出現(xiàn)在2塘5月份，最小值出現(xiàn)在1塘12月份，總體上看2塘異養(yǎng)細菌數(shù)量最高，平均為9.8×103cfu·mL-1，4塘最低，平均為1.3×103cfu·mL-1。圖4-B所示，各養(yǎng)殖塘青蛤腔液中弧菌數(shù)量變化范圍為0～2.1×103cfu·mL-1，最大值出現(xiàn)在2塘6月份，最小值出現(xiàn)在1塘5月份，總體上看2塘弧菌數(shù)量最高，平均為387.5 cfu·mL-1，4塘最低，平均為75 cfu·mL-1。方差分析顯示，不同采樣時間同一塘的青蛤腔液異養(yǎng)細菌總數(shù)差異極顯著(F=4.203，P<0.01)，5月和6月份樣品與其他月份青蛤腔液中異養(yǎng)細菌總數(shù)差異顯著；不同采樣時間弧菌數(shù)量差異較為顯著(F=2.881，P<0.05)，5月與其他月份青蛤腔液中弧菌數(shù)量差異顯著。Pearson相關性分析顯示青蛤腔液異養(yǎng)細菌總數(shù)與養(yǎng)殖密度相關性極顯著(r=-0.189，P<0.01)，弧菌數(shù)量與養(yǎng)殖密度相關性極顯著(r=-0.123，P<0.01)。

圖2 不同月份各養(yǎng)殖塘底泥中異養(yǎng)細菌(A)和弧菌(B)數(shù)量的變動Fig.2 The change trend of total heterotrophic bacteria (A) and the Vibrio (B) number in sediment for all ponds

圖3 同一養(yǎng)殖塘水樣、底泥中的異養(yǎng)細菌總數(shù)和弧菌數(shù)量變化Fig.3 The change trend of total heterotrophic bacteria and the Vibrio number in each ponds

3 討論

養(yǎng)殖塘異養(yǎng)細菌數(shù)量變動與養(yǎng)殖塘中有機質、浮游生物、溫度、及水體營養(yǎng)鹽狀況等密切相關，是養(yǎng)殖塘物理、化學和生物因子綜合作用的結果。由于異養(yǎng)細菌是典型的基質限制性生物，其個體微小、繁殖速度快、生命周期短，因而養(yǎng)殖塘的理化及生物因子的變動容易對異養(yǎng)細菌產生影響。國內外學者對南美白對蝦[11-12]、大黃魚[13-15]、九孔鮑[16]、海參[17-18]、牡蠣[19]等海水養(yǎng)殖動物及其養(yǎng)殖水體、沉積物中的異養(yǎng)細菌及其菌群結構進行了研究，因養(yǎng)殖環(huán)境不同其相應環(huán)境水體中異養(yǎng)細菌數(shù)量亦有差異。本研究中青蛤養(yǎng)殖塘水體中異養(yǎng)細菌總數(shù)的變化范圍為(0.025～57.5)×104cfu·mL-1，與仿刺參、牡蠣養(yǎng)殖水體中的異養(yǎng)細菌總數(shù)變化范圍基本一致[16，19]；青蛤養(yǎng)殖塘底泥中異養(yǎng)細菌總數(shù)變化范圍為1.3×103～1.3×105cfu·mL-1，低于明顯低于對蝦圍塘底泥中總細菌數(shù)[20-21]，后者采用吖啶澄染色熒光顯微直接計數(shù)法統(tǒng)計樣品中的細菌總數(shù)，本實驗統(tǒng)計異養(yǎng)細菌總數(shù)，不包含環(huán)境中非可培養(yǎng)細菌。

圖4 不同月份各養(yǎng)殖塘青蛤腔液中異養(yǎng)細菌(A)和弧菌(B)數(shù)量變動Fig.4 The change trend of total heterotrophic bacteria (A)and the Vibrio (B) number in Cyclina sinensis cavity fluid for all ponds

隨著近年來青蛤養(yǎng)殖技術的成熟，青蛤養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖密度也不斷增加，然而養(yǎng)殖密度過高必然會帶來一系列的養(yǎng)殖問題，故探索適宜的養(yǎng)殖密度是青蛤海水圍塘生態(tài)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。本研究監(jiān)測檢測了不同密度養(yǎng)殖塘水體和底泥中弧菌的數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)水體和底泥中弧菌數(shù)量的變化與樣品中異養(yǎng)細菌總菌的變化顯著相關，水體中弧菌數(shù)量與養(yǎng)殖密度呈負相關而底泥中弧菌數(shù)量與養(yǎng)殖密度呈正相關，這與貝類強大的濾水能力和生物沉降作用有關。另外，水體中的異養(yǎng)菌總數(shù)和弧菌數(shù)量受季節(jié)影響較大，在夏秋高溫季節(jié)水體中異養(yǎng)細菌總數(shù)明顯增高，這主要是受水溫影響，而底泥中的異養(yǎng)細菌和弧菌數(shù)量則受營養(yǎng)鹽累積的影響較大。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)牡蠣養(yǎng)殖水體的異養(yǎng)細菌及弧菌變化趨勢與體腔液中變化一致，只是降了兩個數(shù)量級，本試驗監(jiān)測檢測了青蛤腔液中異養(yǎng)細菌總數(shù)和弧菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)二者與青蛤養(yǎng)殖密度呈顯著負相關，與養(yǎng)殖水體中的菌數(shù)變化趨勢一致且降低了一個數(shù)量級。養(yǎng)殖貝類的微生物性疾病研究表明，青蛤發(fā)生細菌性疾病可能由多種弧菌共同感染所致，而養(yǎng)殖環(huán)境的改變容易致使弧菌大量繁殖，引起疾病的發(fā)生和蔓延[22-23]。

隨著我國淺海和灘涂貝類養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，貝類養(yǎng)殖環(huán)境惡化，易致使病害發(fā)生，而由于貝類底棲埋棲的生活特性，容易造成病害的大面積蔓延而且會進一步破壞底質，因而對貝類養(yǎng)殖環(huán)境的監(jiān)測不僅有利于了解貝類生長過程中對環(huán)境的改變而且有利于掌握貝類生長適宜的環(huán)境條件。本研究發(fā)現(xiàn)，青蛤養(yǎng)殖密度對養(yǎng)殖塘底泥、水體中的異養(yǎng)細菌總數(shù)和弧菌數(shù)量變化無顯著影響，而與青蛤腔液中異養(yǎng)菌數(shù)和弧菌數(shù)量變化相關性極顯著，表明高密度養(yǎng)殖雖然短期內對水體和底泥菌群變化影響不大卻會影響青蛤的健康生長。另外，經過有效指導和合理管理，在青蛤養(yǎng)殖過程中試驗塘未有病害發(fā)生，說明本實驗選取青蛤養(yǎng)殖密度都在養(yǎng)殖環(huán)境容量之內。青蛤養(yǎng)殖密度適宜，加強管理，加大經濟效益的同時注重生態(tài)狀況，可推動青蛤養(yǎng)殖業(yè)更加健康有序發(fā)展。