DEPTOR在直腸癌中的表達及對預后的影響

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(1.蚌埠醫(yī)學院附屬蚌埠市第三人民醫(yī)院腫瘤內科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，安徽 蚌埠 233004；3.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院急診外科，安徽 蚌埠 233004；4.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院胃腸外科，安徽 蚌埠 233004；5.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科，安徽 蚌埠 233004；6.蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內科，安徽 蚌埠 233004)

直腸癌是高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，一經診斷，手術是目前唯一有望獲得根治的治療方法，但術后仍然有一定比例的患者發(fā)生復發(fā)或轉移[1-2]。迄今為止，直腸癌的發(fā)病機制尚不明確，這是限制直腸癌診療水平提高的根本因素。對直腸癌病理組織學的研究有望為探索直腸癌的發(fā)生與發(fā)展提供線索，為臨床診療提供參考。DEPTOR是新近發(fā)現(xiàn)的一種可與雷帕霉素靶蛋白(mechanistic TOR/mammalian, mTOR)結合的富含DEP結構域的蛋白質，為一種內源性mTOR抑制劑，主要功能是在體外及細胞試驗中抑制mTOR的活性[3-5]。現(xiàn)有研究證實，DEPTOR在多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、肝癌等組織中高表達，且提示預后不良[6-7]。但DEPTOR在直腸癌中的表達情況及與預后的關系尚未充分研究。本研究嘗試以直腸癌患者及手術標本為研究對象，采用免疫組化檢測DEPTOR在直腸癌組織中的表達，并進一步分析其與臨床、病理組織學及預后的關系，以期為臨床診療提供參考，為探索直腸癌的發(fā)病提供線索。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2011年1月至2013年1月在我院接受直腸癌根治術的102例患者，采用免疫組化法檢測癌組織及癌旁組織中DEPTOR水平，并計算光密度值(integrated option density，IOD)。以患者癌組織中DEPTOR-IOD中位數(shù)為界將患者分為DEPTOR高表達組及低表達組。納入標準：①均經病理檢查明確診斷為直腸腺癌；②未接受過術前化療及放射治療；③無遠處轉移并成功實施直腸癌R0切除；④術后5年生存資料完整。排除標準：①合并其他組織起源的惡性腫瘤；②臨床資料缺失；③手術標本蠟塊遺失。

1.2 臨床資料及DEPTOR檢測方法

通過電子病歷系統(tǒng)回顧分析患者的臨床資料，包括性別、年齡、體質指數(shù)(body mass index，BMI)、病理診斷結果、術前癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)及糖類抗原199(carbohydrate antigen 199，CA199)。DEPTOR的檢測采用免疫組化法，收集直腸癌術后癌組織及癌旁組織標本，予10%甲醛固定，經脫水處理后再予石蠟包埋。連續(xù)切厚度為4 μm的切片，在60 ℃的環(huán)境下烘干及脫蠟后分別滴加兔抗人多克隆抗體過夜，予以蘇木素染色及脫水后經透明樹膠封片。每張切片在200倍光學顯微鏡下選取5個不同視野觀察免疫組化染色結果，通過軟件(Image-Pro Plus 6.0)計算目標蛋白DEPTOR的IOD值，取平均值作為單張切片的最終結果，并以癌旁組織IOD值為基線分別計算癌組織和癌旁組織的相對IOD值作為后期統(tǒng)計分析的數(shù)值。采用Western blot法評估癌組織及癌旁組織DEPTOR表達水平，取癌組織和癌旁組織充分研磨，提取蛋白，Bradford定量，100 ℃煮沸變性，每孔加入35 μg提取蛋白，經電泳、轉膜、封閉，加入DEPTOR和β-actin(1∶1 000，Abcam公司)一抗稀釋液，4 ℃搖床12 h后滴加二抗，洗膜，滴加ECL顯影液，使用通過軟件(Image-Pro Plus6.0)定量分析條帶灰度值。

1.3 觀察指標

DEPTOR在直腸癌患者癌組織及癌旁組織中的表達差異；分析DEPTOR高表達組與低表達組在臨床及病理組織學上的差異；分析直腸癌患者DEPTOR的表達與外周血CEA及CA199水平的相關性；分析DEPTOR表達水平與患者手術預后的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 DEPTOR在直腸癌患者癌組織及癌旁組織中的表達差異

DEPTOR在癌組織中的相對IOD值為(2.73±0.21)，高于其在癌旁組織中的相對IOD值(1.00) ；兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。Western blot證實DEPTOR在癌組織中的表達水平高于癌旁組織，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖2。

a:癌組織蘇木素染色；b：癌旁組織蘇木素染色；c：癌組織與癌旁組織DEPTOR的IOD值； *：P<0.01

圖1直腸癌組織與癌旁組織DEPTOR表達水平比較(×200)

a：癌組織；b：癌旁組織

2.2 DEPTOR高表達組與低表達組在臨床特征上表達的差異

在直腸癌中，DEPTOR的高表達組與低表達組患者在性別、年齡、BMI差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而在腫瘤直徑、T分期、N分期及分化程度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。將單因素分析所得陽性結果納入Logistic回歸模型進行多因素分析，結果顯示T分期、腫瘤直徑是影響DEPTOR表達的獨立風險因素(P<0.05)，見表2。

表1 2組患者臨床特征表達的差異(n=51，例)

表2 影響DEPTOR表達的多因素分析

2.3 直腸癌患者DEPTOR的表達與外周血CEA及CA199水平的相關性

DEPTOR高表達組患者外周血中CEA水平顯著高于低表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DEPTOR高表達組患者外周血中CA199水平與低表達組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 2組患者外周血中CEA、CA199水平比較(n=51)

2.4 直腸癌患者癌組織中的 DEPTOR的表達水平與外周血CEA水平的相關性分析

直腸癌患者DEPTOR表達水平與外周血CEA水平呈現(xiàn)顯著正相關(r=0.509 ，P<0.01)，見圖3。

圖3直腸癌患者癌組織中的DEPTOR的表達水平與外周血CEA水平的相關性

2.5 DEPTOR表達水平與患者手術預后的關系。

采用Kaplan-Meier生存曲線法對DEPTOR表達水平與患者手術預后的關系進行分析，組間比較通過Log-rankχ2檢驗發(fā)現(xiàn)，直腸癌DEPTOR高表達組患者術后5年累計復發(fā)率顯著高于DEPTOR低表達組，其5年累積死亡率顯著高于DEPTOR低表達組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

3 討論

直腸癌是全球第三大高發(fā)惡性腫瘤，調查顯示每年約有130萬新增直腸癌病例，每年死于直腸癌患者人數(shù)達69萬[8]。我國是直腸癌高發(fā)國家，近年來隨著環(huán)境污染、食品安全及人口老齡化，直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[9-10]。直腸癌的發(fā)生伴隨一系列復雜而漸進的病理生理過程，從腸黏膜損傷、炎癥、上皮內瘤病變直至發(fā)展為原位癌，如未得到有效治療，則進一步進展至浸潤癌[11-12]。直腸癌早期多無特異性臨床改變，這是導致直腸癌早期診斷較為困難的主要原因，相當一部分患者就診時已錯過最佳治療時期，也是部分患者預后不良的主要原因之一[13]。直腸癌一經診斷，手術是有望根治的治療手段[14]。隨著以手術為主的腫瘤綜合治療水平提高，直腸癌術后5年生存率得到了一定提高，但仍然有一部分患者因術后復發(fā)、轉移而死亡[15]。臨床上對于判斷直腸癌手術后的預后并無可靠指標，此外從疾病的發(fā)生、進展及治療等角度分析，深入對直腸癌病理組織學的認識是提供其診療水平的關鍵點[16]。DEPTOR作為一種內源性mTOR抑制劑，是來源于染色體8q24分子量為48 kDa的蛋白質[17]，并且在多種疾病(如肥胖、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌、甲狀腺癌等)中過表達，主要功能是參與細胞增殖過程[18-20]。此外，有文獻報道DEPTOR與多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺腫瘤及肝惡性腫瘤的復發(fā)率也有相關聯(lián)，且與患者的總體生存率呈負相關，是腫瘤不良預后的一個指標[21-22]。但我們發(fā)現(xiàn)DEPTOR在直腸癌組織學領域的研究并不充分。DEPTOR是否在直腸癌組織中異常表達，以及是否可用以判斷患者的手術預后等問題均需要進一步探索。

a: 5年累積復發(fā)率；b：5年累積死亡率

因而我們設計此研究，以直腸癌患者及直腸癌手術切除標本為研究對象，分析DEPTOR在直腸癌組織中的表達改變，與臨床及其他病理組織學改變的關系，并進一步分析其是否有望成為評估手術預后的指標。

本研究首先通過免疫組化法評估癌組織及癌旁組織DEPTOR表達水平，結果顯示直腸癌組織中的DEPTOR表達水平高于癌旁組織，這提示DEPTOR可能參與到直腸癌的發(fā)生與發(fā)展，通過Western blot進一步證實了DEPTOR在癌組織中高表達。同時我們對DEPTOR表達的高低與臨床特征的關系進行了分析，數(shù)據(jù)顯示DEPTOR高表達組直腸癌患者腫瘤直徑、T分期、N分期及分化程度與低表達組患者比較有顯著差異，這提示DEPTOR與直腸癌的進展、轉移及惡性程度有關。此項結論同樣在乳腺癌中得到了證實，如Parvani等[23]的研究顯示，DEPTOR在乳腺癌中過表達，并且與細胞增殖相關。本研究進一步通過將影響DEPTOR在癌組織中表達的陽性單因素結果納入Logistic回歸模型進行多因素分析，結果顯示T分期、腫瘤直徑是影響DEPTOR表達的獨立風險因素，提示DEPTOR的表達與直腸癌的侵襲、增殖等均密切相關，但具體機制有待于進一步探索。CEA是上皮源性腫瘤的標志物，也是臨床用以判斷直腸癌進展、預后及復發(fā)等的常用指標[24-25]。我們分析了直腸癌組織內DEPTOR的表達水平與外周血CEA的相關性，意外發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著正相關關系，提示DEPTOR可能在直腸癌的惡性行為中扮演重要角色。同時，本研究通過Kaplan-Meier生存曲線法分析DEPTOR表達水平與患者手術預后的關系，采用Log-rankχ2檢驗發(fā)現(xiàn)，直腸癌DEPTOR高表達組患者5年累積復發(fā)率及5年累積死亡率均顯著高于DEPTOR蛋白低表達組。這一研究結果提示DEPTOR在直腸癌中的表達水平影響患者的預后，而DEPTOR的表達有望成為輔助判斷直腸癌患者手術預后的指標。

本研究雖然取得一些發(fā)現(xiàn)，但仍然存在以下不足：由于研究對于臨床、病理等資料的完整性要求較高，因而納入的樣本量有限，所得結果仍需進一步擴大樣本量以驗證；本研究屬于回顧性研究，仍然需要開展前瞻性研究以進一步明確DEPTOR在直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及對預后的影響。

綜上所述，DEPTOR在直腸癌中高表達，并與外周血CEA水平呈正相關，DEPTOR的表達水平與腫瘤大小、浸潤、轉移相關，且提示手術預后不良。