鄭海英,黃玥萌,楊春艷，鄢勝飛，李孟琪，于農(nóng)淇，鄭 威，黃加祥，尚江華

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所/農(nóng)業(yè)部(廣西)水牛遺傳繁育重點試驗室，廣西南寧 530001)

p21作為一種可調(diào)控細胞周期的蛋白，在細胞生長、分化、衰老和死亡過程中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤、癌癥也有密切關(guān)系[1]。p21蛋白通過調(diào)控細胞周期來調(diào)節(jié)細胞生長、繁殖、衰老和死亡[2]。當細胞DNA受到損傷時，p21使細胞停滯于G1期，甚至G2期，使細胞有時間對損傷的DNA進行修復(fù)，從而維持細胞遺傳信息的穩(wěn)定性[3]。但另一方面，細胞周期的停滯是衰老的前提，若細胞內(nèi)p21增加，則足以引起細胞衰老[4]。自p21被證明對細胞周期具有負調(diào)控作用以來，研究者發(fā)現(xiàn)p21參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展，其表達使腫瘤細胞發(fā)生不可逆的凋亡；同時，p21調(diào)控細胞周期進程和細胞凋亡過程，若缺失或突變會使細胞分裂復(fù)制、細胞內(nèi)和細胞間的運輸及通訊功能喪失，最終導(dǎo)致細胞衰老、死亡或被其他細胞清除[5]。此外，p21在正常組織中的表達也已有大量報道。Guo Q等[6]發(fā)現(xiàn)高表達的p21使干細胞停滯于G1期；而干擾p21后干細胞出現(xiàn)明顯的DNA損傷和細胞凋亡。在卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育過程中，p21的作用受到了許多關(guān)注。Moore G D等[7]檢測了小鼠卵母細胞p21的表達變化，發(fā)現(xiàn)在無減數(shù)分裂能力的卵母細胞、有減數(shù)分裂能力的卵母細胞以及停滯于M-Ⅱ期的卵母細胞中，p21的表達量無顯著差異；而在胚胎發(fā)育的第2次有絲分裂的G2期，p21的表達量會較第1次有絲分裂驟增2倍～3倍。p21蛋白的表達以及亞細胞定位均可影響小鼠受精卵G2期向M期的轉(zhuǎn)換[8]。在小鼠胚胎發(fā)育過程中，當胚胎細胞快速增殖時，p21只有極弱的特異性表達信號；而當胚胎器官基本形成后，p21的表達信號增強，有利于抑制這些細胞的增殖速度，使細胞轉(zhuǎn)入進一步的分化[9]。在小鼠卵泡的生長、成熟和閉鎖過程中，p21在卵母細胞中也發(fā)揮了一定的作用，參與優(yōu)勢卵泡的選擇和形成[10]。

目前，關(guān)于p21與卵母細胞體外成熟減速分裂核進程的研究已涉及小鼠、牛、山羊等多個物種，趙貴民等[11]已在牛卵母細胞成熟的不同時期均檢測到p21 mRNA的表達。水牛是我國南方奶業(yè)的重要優(yōu)勢品種，了解p21基因在水牛卵母細胞體外成熟過程中的表達規(guī)律和相關(guān)功能，為提高水牛胚胎體外生產(chǎn)提供分子生物學(xué)理論和試驗依據(jù)，對加快奶水牛品種改良具有重要意義。本研究通過檢測水牛卵母細胞體外成熟過程中p21的表達并構(gòu)建pEGFP-N1-p21真核表達載體，為研究p21在水牛卵母細胞體外成熟中的作用機制及下一步生產(chǎn)轉(zhuǎn)p21基因水牛奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水牛顆粒細胞和卵丘-卵母細胞復(fù)合物 水牛顆粒細胞：通過對摩拉水牛進行活體采卵，所得的活采液被放置于體式顯微鏡下，挑揀出水牛卵母細胞后，將剩余的活采液進行離心，收集其中的細胞進行體外培養(yǎng)、分離和傳代，所得細胞即為顆粒細胞。水牛卵丘-卵母細胞復(fù)合體由屠宰場水牛卵巢抽取獲得。

1.1.2 載體與感受態(tài)細胞 pEGFP-N1載體和DH5α感受態(tài)細胞，由廣西水牛研究所遺傳繁育重點試驗室保存。

1.1.3 主要試劑 RNAiso Plus、Hind Ⅲ、KpnⅠ、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)、SYBR? Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0、pMD19-T，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；ReverTra Ace-α-?、ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Remover，Toyobo-東洋紡(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒，天根化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；無內(nèi)毒質(zhì)粒小量提取試劑盒，Omega公司產(chǎn)品；Cell-to-cDNA Ⅱ Kit、T4 DNA Ligase Kit、LipofectamineTM3000 Transfection Kit、DMEM、FBS、Amp+和Kna+，Life公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 參照文獻[12]的引物(p21-F：5′-ATCGAAGCTTACAGGTGCCATGTCTGAGCTGT-3′；p21-R：5′-ATCGGGTACCGCGGG- CTTCCTCCTGGAGCAGAT-3′，擴增產(chǎn)物521 bp)，擴增水牛p21 CDs區(qū)，并在上下游引物中加入Hind Ⅲ、KpnⅠ酶切位點(劃線部分為對應(yīng)酶切位點)。同時參考GenBank中水牛p21 基因mRNA (NM-001098958.2) 序列，利用NCBI primer blast設(shè)計RT-qPCR檢驗擴增引物(F:5′-GAGCGGTGGAACTTCGACTT-3′；R：5′-CAAGTGGTCCTCCTGAGACG-3′，擴增產(chǎn)物186 bp)。內(nèi)參基因選擇β-actin(F:5′-AGCTCGCCATGGATGATGA-3′，R:5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′，擴增產(chǎn)物166 bp)。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2.2 水牛卵丘-卵母細胞體外成熟培養(yǎng) 從南寧市屠宰場收集水牛卵巢，置于30℃～35℃的生理鹽水中3 h內(nèi)運回實驗室，用 9 g/L的雙抗生理鹽水沖洗3次。用注射器抽取直徑為2 mm～8 mm的水牛卵泡液，在體視顯微鏡下用玻璃吸管吸取卵泡液中帶2層以上卵丘細胞、胞質(zhì)均勻的卵母細胞，在洗卵液(含5 g/L NBS、20 mmol/L Hepes的TCM199)中洗2次，再在經(jīng)平衡過的IVM液(TCM199+100 mL/LFBS+10 μg/mL FSH +12 μg/mL LH+1 μg/mL E2+50 μmol/L巰基乙醇)中洗3次，最終放入干凈的IVM液中，收集IVM不同時期水牛卵母細胞。

1.2.3 卵母細胞p21 mRNA表達檢測 按照Cell-to-cDNATMⅡ Kit的說明書收集體外成熟不同時期的水牛卵母細胞40個～50個，用4℃ 1×PBS清洗卵母細胞3遍后，放入10 μL 4℃ Cell Lysis Ⅱ buffer，75℃孵育10 min。冰上冷卻后加入DNase Ⅰ，使其終濃度為0.04 U/μL。37℃孵育15 min后75℃孵育5 min使DNaseⅠ失活。再向裂解液中加入4 μL dNTP Mix，2 μL Random Decamers，70℃孵育3 min后向其加入2 μL 10×RT buffer，1 μL M-MLV Reverse Transcriptase，1 μL RNase Inhibitor，42℃ 30 min，95℃ 10 min后直接獲得cDNA，以其為模板進行RT-qPCR檢測。RT-qPCR反應(yīng)體系為：SYBR? Premix ExTaqTM5.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 3.0 μL，共10.0 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 cycles；95℃ 5 s，60℃ 60 s，95℃延伸，讀取熔解曲線。熒光信號由Loche LightCycler 480采集并分析，利用RQ=2-ΔΔCt方法計算p21的相對表達量。

1.2.4 RT-PCR擴增p21 CDs 按照RNAiso Plus說明書提取摩拉水牛卵巢顆粒細胞總RNA。按照ReverTra Ace-α-?說明書，以摩拉水牛卵巢顆粒細胞總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴增反應(yīng)體系：PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0) 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上、 下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，RNase free H2O 7.0 μL，總體積 20.0 μL。反應(yīng)程序：98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35 cycles；72℃ 5 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0說明書回收PCR產(chǎn)物。

1.2.5 重組質(zhì)粒pMD19-T-p21的構(gòu)建 將回收的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T連接，反應(yīng)體系：pMD19-T Vector 1.0 μL，回收PCR產(chǎn)物4.0 μL，Solution 5.0 μL，共10.0 μL。16℃孵育30min后轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落用Amp+抗性篩選后進行菌液PCR和測序驗證。連接后的重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-p21。按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取pMD19-T-p21質(zhì)粒備用。

1.2.6 真核表達載體pEGFP-N1-p21的構(gòu)建 用Hind Ⅲ和KnpⅠ分別雙酶切 pMD19-T-p21質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒后，利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 回收線性化載體。按照 T4 DNA Ligase Kit說 明 書 將 線 性 化 pEGFP-N1與p21 CDs連接。 反應(yīng)體系：線性化pEGFP-N1 1 μL(100 ng)，p21 CDs 6 μL(≈500 ng)，10×T4 DNA Ligase buffer 2 μL，T4 DNA Ligase 1 μL(1 U)，ddH2O 10 μL，共 20.0 μL。22℃孵育30 min 。連接后的重組質(zhì)粒命名為 pEGFP-N1-p21。轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落用Kna+抗性篩選后進行菌液PCR。將PCR結(jié)果為陽性的菌液擴大培養(yǎng)后按照天根質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，進行雙酶切驗證。酶切體系：質(zhì)粒 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL，KpnⅠ 1 μL，10×Fast Digest Green Buffer 2 μL，ddH2O 15 μL，共20 μL。37℃孵育20 min，80℃孵育10 min，終止反應(yīng)。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢驗酶切結(jié)果。將酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒所對應(yīng)的菌液擴大培養(yǎng)，按照 Omega無內(nèi)毒質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書提取pEGFP-N1-p21質(zhì)粒備用。

1.2.7 細胞培養(yǎng) 將保存于液氮的水牛卵巢顆粒細胞取出后立即放入37℃水浴中，緩慢搖動凍存管，在1 min內(nèi)將其融化完全，2000 r/min離心2 min，去除上層凍存液，加入500 μL 90%DMEM+10%FBS 完全培養(yǎng)基，輕輕吹打?qū)⒓毎靹?，再轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，放入37℃、體積分數(shù)為5% CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待其融合度達90%后以5×105/孔的密度傳代于6孔板中，待融合度達80%后進行轉(zhuǎn)染試驗。

1.2.8 細胞轉(zhuǎn)染 將提取的無內(nèi)毒pEGFP-N1-p21及pEGFP-N1質(zhì)粒稀釋至濃度1 μg/μL，與空白對照(無質(zhì)粒)同時按LipofectamineTM3000 Transfection Kit說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h和48 h用倒置熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。

1.2.9 轉(zhuǎn)染細胞中p21基因RT- qPCR檢測 提取水牛卵巢顆粒細胞總RNA，按照ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Remover說明書制備cDNA。RT-qPCR反應(yīng)體系為：SYBR? Premix ExTaqTM10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 5.0 μL，ddH2O 4.0 μL，共20.0 μL。反應(yīng)程序同1.2.2。熒光信號由Loche LightCycler 480采集并分析，利用 RQ=2-ΔΔCt方法計算p21的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 水牛卵母細胞體外成熟過程中p21的表達

按照Cell-to-cDNATMⅡ Kit的說明書收集體外成熟不同時期的水牛卵母細胞40個～50個，直接獲得cDNA，以其為模板進行RT-qPCR檢測。P21 mRNA相對表達情況如表1。以水牛卵母細胞p21在體外成熟培養(yǎng)0 h為基準，在培養(yǎng)6 h時p21表達量最高，與其他時期的差異極顯著(P<0.01)，隨后p21表達量降低，12 h～24 h之間無明顯差異。有極體的卵母細胞p21表達量顯著高于無極體的卵母細胞(P<0.05)。

2.2 p21基因RT-PCR擴增

以反轉(zhuǎn)錄所得的水牛顆粒細胞cDNA為模板，用引物p21-F和p21-R擴增，目的片段用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，可見一條近500 bp的單一條帶(圖1)。

表1 水牛卵母細胞體外成熟各時期p21相對表達量

注：同行數(shù)據(jù)肩標大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著。

Note：Values within the same column with different capital letters are extremely significantly different (P<0.01), with different small letters are significantly different(P<0.05),and with same letters are not significantly different.

2.3 重組質(zhì)粒鑒定及序列測定

按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0說明書回收PCR 產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物連接至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑選單克隆菌用Amp+進行抗性篩選，菌液PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖2所示，可觀察到大部分菌液樣品均有接近500 bp大小的單一目的條帶。

將陽性菌液的測序結(jié)果與牛p21基因(NM-001098958.2)序列對比，同源性達99%。如圖3所示，水牛p21 cDNA序列與參考基因相比存在5處突變。

M.DNA標準DL 2 000；1.陰性對照；2. p21-F和 p21-R PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control ；2.Products of p21-F and p21-R

圖1水牛顆粒細胞p21 PCR產(chǎn)物

Fig.1 PCR products of p21-F and p21-R

M.DNA標準DL 5 000；1～7. pMD19-T-p21菌液PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 5 000；1-7. PCR products of pMD19-T-p21 bacterial liquid

圖2 pMD18-T-p21菌液PCR

Fig.2 PCR identification of pMD18-T-p21 bacterial liquid

圖3 測序?qū)Ρ冉Y(jié)果

2.4 真核表達載體構(gòu)建結(jié)果

用Hind Ⅲ和KnpⅠ分別雙酶切 pMD19-T-p21質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒后，利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0 回收線性化載體。按照 InvitrogenTMT4 DNA Ligase說明書將線性化pEGFP-N1與p21 CDs連接。連接后的重組質(zhì)粒命名為 pEGFP-N1-p21。轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌用Kna+進行抗性篩選，將菌液 PCR結(jié)果為陽性的菌液提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后將酶切產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖4所示，可觀察到質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ酶切后條帶大小正確。

2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染水牛顆粒細胞

pEGFP-N1-p21、pEGFP-N1和陰性對照同時操作轉(zhuǎn)染水牛顆粒細胞，于24 h和48 h在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光。24 h熒光表達如圖5所示，陰性對照組未觀察到綠色熒光；pEGFP-N1-p21、pEGFP-N1均有綠色熒光蛋白表達。轉(zhuǎn)染試驗重復(fù)3次，均得到一致結(jié)果，表明重組質(zhì)粒pEGFP-N1-p21成功轉(zhuǎn)染至顆粒細胞中并表達出綠色熒光蛋白，證明pEGFP-N1-p21真核表達載體構(gòu)建成功。

2.6 轉(zhuǎn)染細胞中p21基因RT-qPCR檢測

收集轉(zhuǎn)染48 h后的水牛顆粒細胞提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進行RT- qPCR檢測，p21表達情況如圖6。在空白對照p21表達量與pEGFP-N1差異不顯著，與pEGFP-N1-p21差異極顯著；pEGFP-N1與pEGFP-N1-p21差異極顯著(P<0.01)。

M.DNA標準DL 10 000；1. pEGFP-N1-p21雙酶切；2.Hind Ⅲ酶切pEGFP-N1-p21；3.KpnⅠ酶切pEGFP-N1-p21

M.DNA標準DL 10 000；1.Double enzyme digestion of pEGFP-N1-p21;2.pEGFP-N1-p21 digested withHind Ⅲ；3.pEGFP-N1-p21 digested withKnpⅠ

圖4 pEGFP-N1-p21雙酶切結(jié)果

Fig.4 Double enzyme digestion results of pEGFP-N1-p21

A.pEGFP-N1-p21轉(zhuǎn)染;B.pEGFP-N1轉(zhuǎn)染;C.空白對照；A’、B’、C’.對應(yīng)明場

A.pEGFP-N1-p21 transfection;B.pEGFP-N1 transfection;C.Blank control；A’,B’,C’.Transfection with pEGFP-N1-p21,pEGFP-N1 and blank under the common light respectively

圖5綠色熒光蛋白表達情況

Fig.5 Expression of green fluorescent protein

與對照組比較，**表示差異極顯著(P<0.01)

Compared with control group( **P<0.01)

圖6顆粒細胞轉(zhuǎn)染效率

Fig.6 Transfection efficiency of ovarian granulosa cells

3 討論

p21在卵子成熟過程中的作用在多年前已有大量研究。Frank-Vaillant M等[13]對爪蟾卵子的研究提示高水平p21蛋白可間接誘導(dǎo)卵子減數(shù)分裂G2/M期轉(zhuǎn)換受到阻滯。許曉磊[14]將牛pVenus-p21真核表達載體的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物注射入體外成熟培養(yǎng)8 h的牛卵母細胞中，使得牛卵母細胞成熟率出現(xiàn)明顯降低；而在對卵子內(nèi)p21進行干擾后發(fā)現(xiàn)牛卵母細胞成熟率上升。趙貴民[12]在mRNA水平上分析了牛p21在減數(shù)分裂和胚胎發(fā)育不同時期的表達量，發(fā)現(xiàn)p21在MⅠ期和MⅡ期的表達量逐漸升高，進入胚胎發(fā)育階段后表達量下降，到8細胞期后又再次上升，到達囊胚期時表達量最高。本研究在水牛卵母細胞體外成熟過程中的0、6、12、24 h分別對其檢測了p21 mRNA的表達水平，在6 h時p21 mRNA的表達量最高，可能是由于在6 h之前卵母細胞大多數(shù)仍處于GV期，此時卵母細胞正被阻滯在第1次減數(shù)分裂前期的雙線期，這正是p21高表達的結(jié)果。隨后p21表達量急劇降低，并從12 h～24 h p21表達量有緩慢上升的趨勢，但差異不顯著。IVM前12 h是水牛卵母細胞GVBD的發(fā)生時期，其間卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂并進入MⅠ期。后12 h卵母細胞從MⅠ期隨第1極體的排出進入MⅡ期。此時卵母細胞又進入停滯期，直到受精或給予適當刺激時才能解除停滯并恢復(fù)第2次減數(shù)分裂[15]。故而本研究檢測到的水牛卵母細胞體外成熟的12 h～24 h期間p21的表達量與上述的規(guī)律基本符合，與趙貴民的研究結(jié)果一致。此外，本研究檢測到在排出了第1極體的卵母細胞中，p21 mRNA的表達量顯著高于未排出第1極體的卵母細胞(P<0.05)，這也可能是由于這些未排出第1極體的卵母細胞在G2/M轉(zhuǎn)換的過程中受到某些干擾而未能按時完成第1次減數(shù)分裂。

屠宰場來源水牛卵巢的卵母細胞GVBD的發(fā)生具有不均一性[16]，是導(dǎo)致體外生產(chǎn)水牛胚胎成功率顯著降低的重要原因。而在本研究中，p21在GVBD時期(IVM前12 h)的表達發(fā)生了較大變化，這樣的變化是否對卵母細胞的成熟率、受精后的分裂率等有影響還需更進一步的研究。Shang J H等[17]已成功從水牛卵丘-卵母細胞復(fù)合體(COCs)中克隆出p21 CDs，并對其進行了生物信息學(xué)分析。本研究在其基礎(chǔ)上從摩拉水牛顆粒細胞中克隆出p21 CDs并構(gòu)建出pEGPF-N1-p21真核表達載體，轉(zhuǎn)染水牛顆粒細胞后可見綠色熒光，且p21 mRNA的表達量極顯著升高(P<0.01)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，既可表達綠色熒光蛋白，也可轉(zhuǎn)錄出p21 mRNA。p21蛋白的表達量還需后續(xù)試驗驗證。本研究為進一步研究p21在水牛卵母細胞體外成熟以及胚胎發(fā)育過程中的相關(guān)機制奠定了基礎(chǔ)。