吳同壘，靳曉敏，王洪彬，陳 玥，張志強(qiáng)，高桂生，單曉楓，史秋梅*

(1.河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島 066004；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130118)

美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)是嗜鹽病原菌中的重要成員，患病魚臨床以出血性敗血癥為典型特征，發(fā)病急，病程短，病死率高，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。美人魚發(fā)光桿菌包括2個(gè)亞種，即美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種(Photobacteriumdamselaesubsp.damselae)和殺魚亞種(Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida)[3]。美人魚發(fā)光桿菌毒力機(jī)制和基因研究不夠深入，已知高致病力的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種通常攜帶約150 kb的毒力質(zhì)粒，編碼2種關(guān)鍵性的毒力因子溶血素Dly和HlyApl，同時(shí)染色質(zhì)中也攜帶溶血素Hlych基因，這3種溶血素都對(duì)細(xì)菌的毒力有不同程度的影響[4-5]。一般認(rèn)為殺魚亞種不具有溶血素，也不含有這種毒力質(zhì)粒，但致病性與美人魚亞種相比并不弱，且能引起機(jī)體多個(gè)部位的出血性病變[6-7]。

2015年11月，秦皇島昌黎縣某海水養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的大菱鲆(turbot)大量發(fā)病，病魚表現(xiàn)為體表潰瘍，鰭部出血，尾部潰爛，嚴(yán)重腹水。本課題組從腹水中分離鑒定了美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種，并由中國海洋微生物保藏中心命名為MCCC 1K03226。本研究利用PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其攜帶溶血素Hlych基因，原核表達(dá)和免疫原性分析結(jié)果顯示，Hlych蛋白具有良好的免疫原性。分離的美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種獲得了溶血素基因，其毒力可能會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)，而Hlych蛋白可以用于建立ELISA診斷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種MCCC 1K03226，由河北科技師范學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離，中國海洋微生物保藏中心保藏；克隆菌株大腸埃希菌感受態(tài)DH5α、表達(dá)菌株BL21(DE3)和表達(dá)載體pET32a(+)由河北科技師范學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡Balb/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶、dNTP，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ、T4連接酶，D 2 000 plus DNA Maker、預(yù)染蛋白Maker，美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；透析袋和硝酸纖維素膜，Millipore公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒、核酸凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；His標(biāo)簽單克隆抗體、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、羊抗鼠IgG-HRP，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 從NCBI下載Photobacteriumdamselaesubsp.damselaeCIP 102761 (Phdd CIP 102761，基因登錄號(hào)：NZ-ADBS00000000)全基因組序列，利用軟件Vector NTI找到Dly、Hlypl和Hlych基因序列，利用primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物，送生工生物公司北京分公司合成。引物序列如表1。

表1 引物信息

1.2.2 細(xì)菌溶血活性觀察和溶血素基因擴(kuò)增 制備血平板，挑取保存菌種MCCC 1K03226在平板上劃線，30℃培養(yǎng)24 h，觀察溶血活性。按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取DNA。以基因組DNA為模板，用表1中引物，采用降落PCR進(jìn)行擴(kuò)增。

獲得Hlych基因全長(zhǎng)后與T載體按常規(guī)方法連接，獲得重組載體pMD18-T-Hlych，并送生工生物公司北京分公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 對(duì)測(cè)序結(jié)果應(yīng)用NCBI的Blastn工作區(qū)進(jìn)行同源性比對(duì)，應(yīng)用在線軟件ProtParam (http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam) 分析其基本理化特性。應(yīng)用在線軟件PSORTb (http://www.psort.org/psortb/)進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析。

1.2.4 重組表達(dá)載體pET32a-Hlych的構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ對(duì)pMD18-T-Hlych和表達(dá)載體pET32a(+)進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物按照一定比例混合，22℃連接2 h，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)DH5α，涂布含Amp的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落搖菌，使用載體通用引物進(jìn)行PCR鑒定。陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，保存菌種并提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒記為pET32a-Hlych。用提取的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，涂布含Amp的LB固體平板，37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.5 Hlych的原核表達(dá) 挑取Amp平板上的單菌落搖菌過夜，次日吸取1 mL菌液接種100 mL含Amp的液體LB培養(yǎng)基，220 r/min搖菌，至OD 600 nm值達(dá)到約0.6，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h。離心收集菌體，PBS洗滌3次后PBS重懸，加入Loading buffer煮沸裂解，進(jìn)行SDS-PAGE，分離膠濃度為120 g/L。電泳結(jié)束后，凝膠染色脫色觀察結(jié)果，同時(shí)使用His單克隆抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)。

1.2.6 Hlych鼠源多抗血清的制備及效價(jià)測(cè)定 為獲得Hlych鼠源的多抗血清，首先進(jìn)行蛋白純化。誘導(dǎo)表達(dá)后超聲裂解菌體，離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，確定蛋白表達(dá)形式； 用QIAGEN Ni-NTA柱進(jìn)行蛋白純化，用ND2000進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。加入弗氏完全佐劑乳化后免疫6周齡～8周齡Balb/c小鼠，免疫劑量為100 μg/只；3周后加弗氏不完全佐劑乳化后二免，再過2周后加強(qiáng)免疫，二免和加強(qiáng)免疫劑量為50 μg/只。免疫結(jié)束后小鼠眼球取血，分離血清。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的美人魚發(fā)光桿菌MCCC 1K03226，用1 mL PBS洗滌重懸，加入Loading buffer煮樣后，用稀釋200倍的血清進(jìn)行Western blot分析。

以100 ng/孔蛋白包被酶標(biāo)板，血清倍比稀釋為一抗，HRP-羊抗兔二抗為酶標(biāo)抗體，測(cè)定血清抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌溶血活性觀察

挑取美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種MCCC 1K03226單菌落在綿羊血和兔血平板上劃線，觀察其溶血活性。結(jié)果如圖1所示，該菌在綿羊血(圖1A)和兔血(圖1B)平板上均呈β型溶血，顯示該菌具有非常強(qiáng)的溶血活性。

A.綿羊血瓊脂;B.兔血瓊脂

A.Sheep blood agar;B.Rabit blood agar

圖1細(xì)菌溶血性觀察

Fig.1 Observation of colonial hemolytic activity

2.2 溶血素基因檢測(cè)及Hlych基因擴(kuò)增

以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，采用設(shè)計(jì)合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。如圖2A所示，3種溶血素中，Hlych基因(約420 bp)檢測(cè)為陽性，因此判斷該菌攜帶Hlych基因。根據(jù)NCBI公布的Hlych序列，利用SignaIP進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，用引物Hlych-F和Hlych-R擴(kuò)增去除信號(hào)肽編碼序列的Hlych基因，結(jié)果如圖2B，條帶大小與預(yù)期符合(約1 716 bp)。

A．3種溶血素基因的檢測(cè)；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.Hlych；2.Hlypl；3.Dly；B．Hlych基因擴(kuò)增；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.Hlych

A．Detection of 3 hemolysin genes;M.DNA Marker DL 2 000; 1.Hlych; 2.Hlypl; 3.Dly; B．Ampllication of Hlychgene:M.DNA Marker DL 2 000; 1.Hlych

圖2溶血素基因的檢測(cè)

Fig.2 Detection of hemolysin genes

2.3 Hlych生物信息學(xué)分析

比對(duì)結(jié)果顯示，Hlych基因與美人魚發(fā)光桿菌溶血素HlyA基因同源性達(dá)到99%，因此確定成功獲得了美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種MCCC 1K03226的Hlych基因全長(zhǎng)。分析結(jié)果顯示，該基因編碼蛋白大小(去除信號(hào)肽)為64.7 ku；半衰期為20 h (體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi))，穩(wěn)定系數(shù)為40.17，屬易降解蛋白。蛋白質(zhì)亞定位分析顯示Hlych為胞外蛋白，這與其發(fā)揮的生物學(xué)功能相適應(yīng)，蛋白能夠被分泌出細(xì)菌細(xì)胞，從而引起溶血等一系列作用。

Chou-Aasman方法進(jìn)行DNA Star分析顯示，Hlych二級(jí)結(jié)構(gòu)包括14個(gè)ɑ螺旋，22個(gè)β折疊和50個(gè)轉(zhuǎn)角(圖3)。

圖3 Hlych二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 Hlych誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot驗(yàn)證

經(jīng)過PCR鑒定，重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Hlych轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4A所示，目的蛋白符合預(yù)期大小(預(yù)期蛋白大小約為79 ku)，而空載對(duì)照(empty vector)表達(dá)的蛋白約20 ku。利用His單克隆抗體進(jìn)行Western blot分析，如圖4B所示，在相應(yīng)位置也出現(xiàn)預(yù)期印跡條帶。SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果說明，Hlych蛋白獲得了表達(dá)。

2.5 Hlych鼠源抗血清的制備及效價(jià)測(cè)定

為了獲得純化的Hlych蛋白，首先確定蛋白表達(dá)形式，誘導(dǎo)的菌體超聲裂解后取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，顯示目的蛋白為包涵體表達(dá)。利用Ni-柱進(jìn)行蛋白純化，如圖5A所示，蛋白純化效果良好。純化的蛋白與弗氏佐劑乳化，免疫小鼠后眼球采血分離血清，1∶200稀釋后進(jìn)行Western blot分析，如圖5B所示，在約79 ku處出現(xiàn)了明顯的印跡條帶，與預(yù)期蛋白大小一致，說明Hlych具有一定的免疫原性。 經(jīng)過ELISA測(cè)定，在蛋白包被濃度為100 ng/孔時(shí)，確定該血清的抗體效價(jià)為1∶5 000。

A.SDS-PAGE;1.Hlych；2.空載對(duì)照; B．Western blot;1.Hlych；2.空載對(duì)照A.SDS-PAGE;1.Hlych; 2.Control; B．Western blot;1.Hlych; 2.Control

A．Hlych蛋白純化;M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.蛋白純化前；2.蛋白純化后；B．血清Western blot驗(yàn)證；1.陽性血清；2.陰性對(duì)照

A.Protein purification of Hlych；M.Protein molecular weight Marker; 1.Before purification; 2.After purification; B.Western blot based on serum；1.Positive serum; 2.Negative serum

圖5 Hlych蛋白純化及血清Western blot驗(yàn)證

Fig.5 Protein purification of Hlychand Western blot based on serum

3 討論

美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)是嗜鹽病原菌中的重要成員，感染該菌的患病魚臨床以出血性敗血癥為典型特征，發(fā)病迅速，病死率高，對(duì)海洋經(jīng)濟(jì)魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[6，8-9]。課題組前期從發(fā)病的大菱鲆體內(nèi)分離到美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種，該菌具有溶血活性，同時(shí)表現(xiàn)出對(duì)大菱鲆的較強(qiáng)致病性。目前研究認(rèn)為，美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種共編碼3種溶血素，其中Hlypl和Dly由質(zhì)粒編碼，Hlych由染色質(zhì)編碼[10-11]。本研究對(duì)分離得到的美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種進(jìn)行這3種溶血素基因的PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，該菌株具有溶血素Hlych基因，不攜帶Hlypl和Dly基因。有研究表明攜帶溶血素基因的菌株，往往比不攜帶的菌株毒力強(qiáng)，由于攜帶溶血素Hlych基因，這也在一定程度上解釋了本次分離的菌株具有較強(qiáng)的致病性的原因。溶血素基因往往由基因轉(zhuǎn)移而來，我國國內(nèi)美人魚發(fā)光桿菌的毒力可能伴隨多種毒力基因的轉(zhuǎn)移而逐漸增強(qiáng)[11-13]。從國內(nèi)近幾年的報(bào)道，結(jié)合本課題組的調(diào)查研究，美人魚發(fā)光桿菌已經(jīng)具備了較強(qiáng)的毒力，可造成大菱鲆和舌鰨等海魚大批死亡[14]。

溶血素是美人魚發(fā)光桿菌重要的毒力因子之一，能夠作用于紅細(xì)胞的脂質(zhì)雙分子層，使細(xì)胞膜形成空洞，改變細(xì)胞膜的通透性，引起紅細(xì)胞的破裂溶解，從而釋放出更多的血紅素，為其提供更多的Fe3+，最終導(dǎo)致海水養(yǎng)殖動(dòng)物組織器官的壞死，甚至造成感染動(dòng)物的死亡[15]。通過對(duì)該菌Hlych基因全長(zhǎng)的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因與美人魚亞種溶血素基因同源性達(dá)到99%以上，因此判定該基因?yàn)槿苎鼐幋a基因。細(xì)胞定位預(yù)測(cè)為胞外蛋白，提示該蛋白能夠被分泌出細(xì)菌細(xì)胞，從而發(fā)揮溶血等一系列生物學(xué)功能[16]。

美人魚發(fā)光桿菌病目前沒有有效的診斷方法，原核表達(dá)和免疫原性分析結(jié)果表明該菌的Hlych蛋白具有良好的免疫原性，可以用于建立ELISA診斷方法。目前本課題組正在利用該蛋白進(jìn)行ELISA方法的開發(fā)，希望能夠?yàn)楦叨玖γ廊唆~發(fā)光桿菌病提供快速診斷方法。同時(shí)，由于其具有良好的免疫原性，又是細(xì)菌重要的毒力因子，有潛在的作為亞單位疫苗開發(fā)的價(jià)值。