林 立， 李仁勇， 王琳琳， 邱 云

(1．國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094;2．中科譜研(北京)科技有限公司，北京100027)

牛肝菌類是牛肝菌科和松塔牛肝菌科等真菌的統(tǒng)稱，大部分品種可食用。其中以美味牛肝菌最為著名，其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，成為世界聞名的食用菌之一，在歐洲更被稱為“王者牛肝菌”。我國云南、四川、西藏、貴州等多地區(qū)盛產(chǎn)美味牛肝菌［1］，其已成為我國出口量最大的野生食用牛肝菌品種。牛肝菌含有豐富的營養(yǎng)成分，如多糖、甾體、萜類、多酚、氨基酸和生物堿等［2，3］，其中常見的生物堿主要有膽堿和腺嘌呤等。膽堿是正常代謝不可缺少的物質(zhì)，具有促進(jìn)腦發(fā)育和提高記憶力等作用。另外，牛肝菌還含有豐富的氨基酸，其中精氨酸和鳥氨酸在細(xì)菌氨基酸脫羧酶作用下脫羧生成腐胺，賴氨酸脫羧生成尸胺。腐胺、尸胺氣味難聞，影響食品風(fēng)味和品質(zhì)，還可能與亞硝酸鹽形成致癌的亞硝胺［4］，腐胺還可導(dǎo)致尼古丁的生成［5］。

目前對于食品中膽堿的研究常用酶比色法［6］和雷氏鹽比色法［7］。比色法存在操作繁瑣、干擾因素多等問題。生物胺檢測有簡便、快速的酶生物傳感器法［8］，但所用特異性酶成本昂貴不利于推廣。液相色譜法［9，10］是目前檢測膽堿和生物胺最常用的方法，通常采用帶有陽離子交換基團(tuán)的硅膠色譜柱，因膽堿、腐胺和尸胺分子本身缺乏發(fā)色基團(tuán)，需要使用通用型檢測器(如蒸發(fā)光散射檢測器)。此類帶有陽離子交換基團(tuán)的硅膠色譜柱對pH耐受范圍窄，柱壽命相對較短，且蒸發(fā)光散射檢測器的靈敏度相對較低，穩(wěn)定性較差。若要提高檢測靈敏度，需要采用柱前或柱后衍生技術(shù)，以紫外［11］或熒光檢測器［12，13］進(jìn)行檢測，但方法相對繁瑣。離子色譜法［14－17］則使用pH耐受極強(qiáng)的聚合物陽離子交換柱，無需復(fù)雜前處理和衍生，對于膽堿和大部分生物胺可直接使用電導(dǎo)檢測［14－16］，靈敏度遠(yuǎn)高于蒸發(fā)光散射檢測器和熒光檢測器。柱后加堿安培法則可檢測幾乎全部常見生物胺［17］。

關(guān)于牛肝菌中膽堿、腐胺和尸胺含量的測定，尚未見到相關(guān)研究報道。本研究使用離子色譜法同時檢測了美味牛肝菌樣品中的膽堿、腐胺和尸胺，用高容量陽離子交換色譜柱進(jìn)行分離，用抑制型電導(dǎo)檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器和試劑

ICS-3000型離子色譜儀、IonPac CG17保護(hù)柱(50 mm×4 mm)、IonPac CS17分析柱(250 mm×4 mm)、OnGuardⅡ RP固相萃取柱(1 mL)和CSRS 300抑制器(4 mm)均購于美國Dionex公司;Milli Q超純水機(jī)(美國Millipore公司);0.22 μm微孔尼龍膜(天津富集公司)。甲基磺酸(純度99%，美國Acros Organics公司);氯化膽堿(純度99.98%，美國Sigma-Aldrich公司);腐胺(純度99%)和尸胺(純度98%)均購自德國 Dr．Ehrenstorfer公司;美味牛肝菌干片樣品采集自市場。

1．2 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制

準(zhǔn)確稱取適量氯化膽堿、腐胺、尸胺標(biāo)準(zhǔn)品，分別用水溶解并配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于4℃保存。

準(zhǔn)確移取5.00 mL膽堿貯備液、2.50 mL腐胺貯備液和2.50 mL尸胺貯備液到25 mL容量瓶中，以超純水定容至刻度，搖勻配制得到200 mg/L膽堿、100 mg/L腐胺和100 mg/L尸胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃保存。

1．3 淋洗液配制

稱取0.671 8 g甲基磺酸，以超純水稀釋并定容到1 L，配制7 mmol/L甲基磺酸淋洗液。此溶液也用于樣品提取。

1．4 前處理方法

稱取粉碎后的美味牛肝菌樣品0.200 g，加入100 mL 7 mmol/L甲基磺酸溶液，在搖床上以200 r/min的速度振蕩2 h。經(jīng)3 000 r/min的速度離心，取上清液，通過0.22 μm 尼龍濾膜和OnGuardⅡRP固相萃取柱(2.5 mL)，棄去初始6 mL流出液后收集2 mL流出液，直接進(jìn)樣分析。

1．5 測定條件

色譜柱:IonPac CS17(250 mm×4 mm)分析柱，IonPac CG17(50 mm×4 mm)保護(hù)柱;柱溫:30℃;進(jìn)樣體積:25 μL;使用7 mmol/L甲基磺酸等度淋洗;流速:1.00 mL/min;檢測方式:抑制型電導(dǎo)，CSRS 300抑制器(4 mm)，抑制電流為15 mA，自循環(huán)模式。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜柱、淋洗液和檢測方式的選擇

常用抑制型陽離子交換分離柱有IonPac CS12A、CS16和CS17。其中CS12A屬于中低疏水的色譜柱，CS16均屬于中等疏水的色譜柱，而CS17則屬于極低疏水色譜柱。雖然3者均為高容量色譜柱(具體性能比較見表1)，但其中CS17柱容量相對較低。膽堿屬于單胺，保留相對較弱，在3種色譜柱均能實(shí)現(xiàn)較好分離。而腐胺和尸胺均屬于二胺，在色譜柱上保留行為非常強(qiáng)。因此若需保證膽堿、腐胺和尸胺同時測定，應(yīng)盡可能選擇疏水性低和柱容量相對較低的色譜柱，CS17是最佳色譜柱選擇。

表1 常見陽離子交換色譜柱性能比較Table 1 Comparison of the performance of the common cation exchange chromatography columns

本方法研究了甲烷磺酸濃度對樣品分析的影響，以確定最佳的淋洗液條件。觀察實(shí)際樣品分離譜圖可發(fā)現(xiàn)，在腐胺的色譜峰前存在一個非常相近的未知峰，因此選擇該峰與腐胺的分離度作為評價分析方法的主要指標(biāo)。如圖1所示，當(dāng)甲烷磺酸的濃度為10 mmol/L時，該未知峰與腐胺分離度僅能達(dá)到1.2，不能實(shí)現(xiàn)基線分離，從而影響結(jié)果準(zhǔn)確性。隨著甲烷磺酸濃度逐步降低至8 mmol/L時，二者的分離度可達(dá)到1.6。繼續(xù)研究了淋洗液濃度為7和6 mmol/L時的分離情況，分離度進(jìn)一步可提高到1.8和1.9。但由試驗(yàn)譜圖可見，隨著甲烷磺酸濃度的逐漸降低，分析時間不斷增加，意味著分析效率的逐漸降低。綜合考慮分離度、分析時間以及方法的耐用性，選擇7 mmol/L甲基磺酸溶液作為最優(yōu)和最終分離條件。

圖1 甲基磺酸濃度對分離的影響Fig．1 Effects of the concentration of methanesulfonic acid(MSA)on the separation

由于膽堿、腐胺和尸胺的酸電離常數(shù)的負(fù)對數(shù)pKa均大于10，即堿電離常數(shù)的負(fù)對數(shù)pKb小于4，表明這3種有機(jī)堿性化合物為弱堿性(pKb小于5)，可發(fā)生電離，因而在電導(dǎo)檢測器上會有響應(yīng)。牛肝菌樣品中一般含有較高濃度的氨基酸，因其具有氨基結(jié)構(gòu)，在酸性淋洗液下可在陽離子交換色譜柱上保留，且在電導(dǎo)檢測器上也會有響應(yīng)。但因其具有羧基，若采用陽離子抑制器，氨基酸會吸附在抑制器的陰離子交換材料上，在電導(dǎo)檢測器上不出峰，可避免共存氨基酸對膽堿、腐胺和尸胺的干擾。此外，與傳統(tǒng)非抑制法相比，抑制法的淋洗液經(jīng)過抑制后，背景電導(dǎo)和噪音降低，檢測靈敏度也得到提高。因此綜合考慮上述原因，選擇抑制型電導(dǎo)法檢測更為適合。

2．2 樣品共存干擾及前處理方法的選擇

美味牛肝菌中可能在陽離子交換柱上保留并干擾測定的組分主要有氨基酸、腺嘌呤、常見堿金屬和堿土金屬、銨和乙酰膽堿等。配制可能共存物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)鋰、鈉、銨、鉀、鎂、鈣、乙酰膽堿與膽堿、腐胺和尸胺的分離度均達(dá)到2以上。未觀察到常見氨基酸和腺嘌呤的明顯色譜峰，表明其對這3種待測物質(zhì)的測定也不存在干擾。分離譜圖見圖2。

圖2 膽堿、腐胺、尸胺與可能共存物質(zhì)的分離Fig．2 Separation of choline，putrescine，cadaverine and the possible coexisting substances

樣品提取液包含有機(jī)大分子物質(zhì)，為避免污染色譜柱，需在進(jìn)樣前預(yù)先凈化。目前可用于吸附有機(jī)大分子物質(zhì)的固相萃取柱主要有反相柱(多孔二乙烯基苯樹脂)和石墨化炭黑柱，但初步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用這兩種類型固相萃取柱凈化提取樣品時，腐胺和尸胺的回收率會存在20%以上的損失。嘗試了不同濃度的甲基磺酸提取溶液對測定結(jié)果的影響。發(fā)現(xiàn)以RP柱凈化樣品時，若樣品中存在5到20 mmol/L甲基磺酸，膽堿、腐胺和尸胺的回收率為97.8%～100.8%(見表2)。因此可直接選擇 7 mmol/L甲基磺酸淋洗液作為提取溶液。而在石墨化炭黑柱上，即使使用甲基磺酸也無法改善腐胺和尸胺的低回收率問題。

表2 提取溶液中MSA的濃度對分析物回收率的影響Table 2 Effect of the MSA concentrations in the extraction solution on the recoveries of the analytes

2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢出限

膽堿、腐胺和尸胺在0.01～10 mg/L范圍內(nèi)均可以獲得良好的線性，相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.999 9、0.999 7和0.999 9。膽堿、腐胺和尸胺的工作曲線結(jié)果見表3。由S/N=3估算方法檢出限:膽堿為0.002 mg/L，腐胺為0.002 mg/L，尸胺為0.003 mg/L。對應(yīng)于實(shí)際樣品中的檢出限分別是:膽堿為1.0 mg/kg，腐胺為1.0 mg/kg，尸胺為1.5 mg/kg。

表3 膽堿、腐胺和尸胺的線性范圍、線性方程和線性相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear ranges，linear equations and correlation coefficients(R2) of choline，putrescine and cadaverine

2．4 實(shí)際樣品測定結(jié)果、加標(biāo)回收率和精密度

通過對實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)考察方法的準(zhǔn)確性。先稱取約0.2 g樣品到100 mL容量瓶中，分別加入膽堿、腐胺和尸胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.500、1.000和2.000 mL，混勻后用7 mmol/L甲基磺酸溶液定容到刻度，用1.4節(jié)方法處理后進(jìn)行檢測。加標(biāo)樣品的色譜圖見圖3，具體測定結(jié)果見表4。加標(biāo)回收率為 91.6%～100.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%～2.11%。結(jié)果表明，離子色譜法對膽堿、腐胺和尸胺的測定具有良好的可靠性。

對附近市場中購買到的美味牛肝菌樣品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示樣品中可檢測到膽堿和腐胺，而尸胺則未被檢測到，樣品色譜圖見圖3。

圖3 美味牛肝菌樣品提取液色譜圖Fig．3 Chromatograms of the boletus edulis extract

表4 美味牛肝菌樣品的加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和含量(n=3)Table 4 Spiked recoveries，RSDs and contents of the boletus edulis sample(n=3)

3 結(jié)論

建立了美味牛肝菌中膽堿、腐胺和尸胺的離子色譜分析方法，利用親水性陽離子交換色譜柱Ion-Pac CS17進(jìn)行分離，使用抑制型電導(dǎo)檢測器測定了牛肝菌樣品中的3種有機(jī)堿。方法操作簡單，無需衍生，抗干擾能力強(qiáng)，靈敏度高，適用于牛肝菌樣品的分析，可用于相關(guān)制品的生產(chǎn)質(zhì)量控制，為保證食品安全提供了保障。此方法還可用于牛肝菌樣品中鈉、鉀、鎂、鈣、乙酰膽堿等的測定，有待進(jìn)一步研究。