王維娟，方 璇，厲小梅，汪國生，陶金輝，王 鋼，李向培

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種彌漫性自身免疫性結(jié)締組織病，臨床上可累及全身多個系統(tǒng)，血液系統(tǒng)損害較為常見，其中血小板減少是SLE患者常見臨床表現(xiàn)之一。具有明顯出血傾向的血小板減少癥在SLE患者中并不常見，但是嚴重者出現(xiàn)腦出血或消化道出血可危及生命。頑固性血小板減少癥目前仍是臨床治療中的一大難題，是SLE患者預(yù)后不良的獨立危險因素[1]。探討SLE血小板減少的致病機制，尋找其有效治療方法尤為重要，目前研究主要集中在多種自身抗體，包括抗血小板抗體、抗血小板生成素(thrombopoietin，TPO)抗體、抗血小板生成素受體(c-mpl)抗體等[2]。TPO是骨髓巨核細胞分化、成熟和釋放血小板的主要細胞因子，通過與靶細胞膜表面特異性受體c-mpl結(jié)合發(fā)揮其生理作用。但目前未見同時研究TPO、抗TPO抗體及抗c-mpl抗體及其相關(guān)性的報道。該研究旨在探討抗TPO抗體及抗c-mpl抗體與SLE患者血小板減少之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1研究對象選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕科門診或住院的SLE患者共62例,均符合1997年美國風(fēng)濕病協(xié)會制定的SLE診斷標準。其中伴血小板減少SLE患者36例(血小板<100×109/L，A組)，血小板計數(shù)4×109/L～98×109/L，平均(58.4±25.5)×109/L；無血小板減少SLE患者26例(B組)，血小板計數(shù)101×109/L～370×109/L，平均(184.0±73.6)×109/L。A組36例，男5例，女31例，年齡20～64歲，平均(35.75±10.87)歲，病程1周～240月，平均(53.85±62.29)月。B組26例，男2例，女24例，年齡15～63歲，平均(35.88±11.68)歲，病程1～276月，平均(60.65±74.07)月。健康對照組11例(C組)，男3例，女8例，年齡21～42歲，平均(30.55±7.16)歲，血小板計數(shù)正常且無風(fēng)濕性疾病及血液系統(tǒng)疾病等。三組間性別、年齡匹配，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.496,P=0.269；F=1.125,P=0.330)。A、B兩組間病程差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.392，P=0.697)。所有納入的研究對象符合倫理學(xué)標準并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1收集SLE患者的臨床資料 包括年齡、病程、臨床表現(xiàn)等情況，采用系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease index，SLEDAI)評估SLE的疾病活動度。

1.2.2檢測指標 包括血常規(guī)、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate， ESR)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、補體C3、C4、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)、抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA)等。

1.2.3血清抗TPO抗體、血清抗c-mpl抗體及血清TPO水平檢測 采集靜脈血5 ml，2 000 r/min離心5 min，上清液置于EP管中，-80 ℃冰箱保存待測。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清TPO水平，按照試劑盒說明書要求進行操作。采用間接ELISA法檢測血清抗TPO抗體及抗c-mpl抗體。具體如下:分別用重組人TPO及c-mpl(美國R&D System公司)以4 mg/L濃度包被ELISA微孔板(美國R&D System公司)，4 ℃過夜，洗滌6次后加入0.05 g/L小牛血清蛋白(美國R&D System公司)封閉非特異性位點，37 ℃溫育1 h，洗滌后每孔位加入100 μl待測血清，洗滌后加入酶標抗體工作液(上?？菩律锛夹g(shù)股份有限公司)，洗滌后每孔加入TMB使用液(美國R&D System公司)100 μl，37 ℃溫育20 min后加入稀硫酸終止反應(yīng)，最后用酶標儀450 nm波長下測定吸光度值。陽性判斷標準：吸光度值大于或等于C組平均值2.1倍及以上。分析其與臨床表現(xiàn)、實驗指標及SLEDAI之間的關(guān)系

2 結(jié)果

2.1血清TPO水平血清TPO水平在A、B 兩組及健康對照組中分別為(220.30±173.45)ng/L、(149.05±94.49)ng/L和(74.86±25.90)ng/L，三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.495，P=0.006)，A組明顯高于C組(t=2.751,P=0.009)。

2.2血清抗TPO抗體水平

2.2.1血清抗TPO抗體檢出率 SLE患者中抗TPO抗體總陽性率41.9%(26/62)，在A組、B組和C組的陽性率分別為55.6%(20/36)、23.1%(6/26)和0(0/11)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，抗TPO抗體在A、B兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.2血清抗TPO抗體與SLE患者臨床表現(xiàn)和實驗指標的關(guān)系 抗TPO抗體陽性者易出現(xiàn)皮疹(P<0.05)；抗體陰性者易出現(xiàn)抗核小體抗體(P<0.05)；抗體陰性組較抗體陽性組APTT、PT均延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但兩組APTT、PT數(shù)值均在正常范圍內(nèi)；抗TPO抗體陽性組和陰性組間血小板計數(shù)、血清補體C3及C4、ESR、CRP、抗dsDNA陽性率、抗β2-GP1及SLEDAI評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、2。

2.3血清抗c-mpl抗體

2.3.1血清抗c-mpl抗體檢出率 SLE患者中抗c-mpl抗體總陽性率為25.8%(16/62)，抗c-mpl抗體在SLE伴血小板減少組、SLE血小板正常組和健康對照組的陽性率分別為25%(9/36)、26.9%(7/26)和0，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，抗c-mpl抗體陽性率在A、B兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.2血清抗c-mpl抗體與SLE患者臨床表現(xiàn)和實驗指標的關(guān)系 抗c-mpl抗體陽性者易出現(xiàn)皮疹(P<0.05)；抗c-mpl抗體陽性組和陰性組間血小板計數(shù)、血清TPO、血清補體 C3及 C4、ESR、CRP、抗dsDNA陽性率、抗β2-GP1、APTT、PT及SLEDAI 評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3、4。

2.4SLE患者不同血小板計數(shù)間抗TPO抗體、抗c-mpl抗體陽性率比較將SLE血小板減少患者分為三組：Ⅰ組(10例)，血小板<50×109/L；Ⅱ組(16例)，50×109≤血小板<70×109/L；Ⅲ組(10例)，70×109≤血小板<100×109/L，組間比較抗TPO抗體、抗c-mpl抗體差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三組分別與B組比較，Ⅲ組抗TPO抗體陽性率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)，余兩組抗TPO抗體陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；三組抗c-mpl抗體分別與B組比，陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5血清TPO、抗TPO抗體、抗c-mpl抗體相關(guān)性

2.5.1SLE患者血清TPO、抗TPO抗體、抗c-mpl抗體相關(guān)性 SLE患者抗TPO抗體陽性率與抗c-mpl抗體呈正相關(guān)(r=0.320，P=0.011)；抗TPO抗體、抗c-mpl抗體均與血清TPO水平無明顯相關(guān)性(r=0.054，P=0.677；r=0.035，P=0.787)。

表1 抗TPO抗體陰性組與陽性組臨床表現(xiàn)的比較[n(%)]

表2 抗TPO抗體陰性組與陽性組實驗室指標的比較

表3 抗c-mpl抗體陰性組與陽性組臨床表現(xiàn)的比較[n(%)]

表4 抗c-mpl抗體陰性組與陽性組實驗室指標的比較

2.5.2SLE伴血小板減少患者血清TPO、抗TPO抗體、抗c-mpl抗體相關(guān)性 SLE血小板減少患者抗TPO抗體陽性率與抗c-mpl抗體呈正相關(guān)(r=0.387，P=0.020)；抗TPO抗體、抗c-mpl抗體均與血清TPO水平無明顯相關(guān)性(r=-0.016，P=0.926；r=0.083，P=0.629)。

3 討論

SLE是一種可累及全身多個系統(tǒng)的慢性自身免疫性炎性疾病，血小板減少是SLE患者較為常見的血液系統(tǒng)受損表現(xiàn)，發(fā)生率為7%～40%，其中重度難治性血小板減少不足5%[3]。其發(fā)病機制尚不明確。TPO是骨髓巨核細胞發(fā)育成熟和血小板生成的主要生理性調(diào)節(jié)因子，其受體c-mpl主要表達在血小板、巨核細胞及CD34+細胞膜上。TPO通過與靶細胞膜上特異性高親和力c-mpl受體結(jié)合激活JAK和STAT等信號通路，以誘導(dǎo)巨核細胞分化成熟和促進血小板生成[4]。目前血清TPO水平體內(nèi)調(diào)控機制尚不明確, 多認為主要受巨核細胞數(shù)和血小板數(shù)及其膜表面c-mpl受體調(diào)控，當巨核細胞或血小板數(shù)增多時，TPO與c-mpl相結(jié)合導(dǎo)致循環(huán)血液中TPO含量降低；而當巨核細胞或血小板數(shù)減少時，TPO含量升高。多數(shù)研究[5-7]顯示，SLE患者體內(nèi)血清TPO水平較健康對照者明顯升高，而SLE伴血小板減少者更甚。另有研究[8]顯示，SLE患者體內(nèi)TPO水平升高與其合并血小板減少癥和血栓癥無關(guān)，而與白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)和巨噬細胞炎癥蛋白-1α等炎性介質(zhì)相關(guān)。

2000年，Vadhan-Raj et al[9]報道發(fā)現(xiàn)了抗TPO 抗體的存在。2002年，F(xiàn)üreder et al[5]采用酶聯(lián)免疫分析法(EIA)在SLE患者血清中檢測到該抗體，并發(fā)現(xiàn)SLE血小板減少組較SLE血小板正常組抗TPO抗體檢出率高；在血小板減少SLE患者中，抗TPO抗體陽性者血小板下降更明顯，推測可能抗TPO抗體與SLE患者血小板減少相關(guān)。2006年，Ziakas et al[6]改良了Füreder的方法，在SLE患者中再次檢測到抗TPO抗體，其檢出率為36.8%(7/19)，并發(fā)現(xiàn)該抗體在體外可以抑制巨核細胞的增殖。本研究顯示，SLE患者中抗TPO抗體總的陽性率為41.9%，與既往文獻報道相近。A組較B組抗TPO抗體陽性率升高(P<0.05)，抗TPO抗體陽性者較陰性者血小板計數(shù)明顯減少，提示抗TPO抗體與SLE血小板減少有一定相關(guān)性。本研究顯示抗TPO抗體陽性組與陰性組血清TPO水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示該抗體引起血小板減少不僅僅是中和TPO導(dǎo)致骨髓巨核細胞發(fā)育分化受到抑制，可能有更多更復(fù)雜的機制參與血小板減少。

Kuwana et al[10]報道了SLE患者抗c-mpl 抗體的存在，發(fā)現(xiàn)11.6%(8/69)SLE患者及8.3%(7/84)ITP患者檢測出該抗體，而健康者未被檢出。Kuwana et al[2]再次報道了1例合并血小板減少的系統(tǒng)性硬化癥患者血清抗c-mpl抗體陽性，而抗磷脂抗體、抗血小板抗體及抗TPO抗體均陰性，提示血小板減少與該抗體相關(guān)。本研究提示，SLE患者抗c-mpl抗體總的陽性率為25.8%，A、B 兩組患者中抗c-mpl抗體的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而健康者體內(nèi)未檢出，與楊拓 等[7]報道一致。楊拓等[7]發(fā)現(xiàn)抗c-mpl抗體陽性組SLE患者血小板計數(shù)明顯低于陰性組，而血清TPO水平明顯高于陰性組,推測抗c-mpl抗體可能通過與TPO競爭結(jié)合c-mpl阻斷了TPO/c-mpl通路，使巨核細胞分化、成熟障礙，從而引起血小板減少。而本研究得出兩組間血小板計數(shù)和血清TPO水平差異雖然無統(tǒng)計學(xué)意義，但血清TPO水平陽性組高于陰性組。提示抗c-mpl抗體可能與SLE伴血小板減少相關(guān)，可能與本研究樣本量較小、檢測方法等多方面因素影響有關(guān)，需要一個更大樣本量、多種檢測方法、多中心研究來進一步驗證。

目前抗TPO抗體及抗c-mpl抗體作用機制尚不完全清楚。羅雄燕 等[11]通過對176例SLE患者骨髓像分析，發(fā)現(xiàn)與SLE血小板正常患者相比,SLE血小板減少患者幼稚巨核細胞明顯增多，而巨核細胞總數(shù)和產(chǎn)板型巨核細胞均明顯減少，提示SLE血小板減少與巨核細胞增殖分化障礙相關(guān)。多數(shù)研究[12]顯示抗TPO 抗體陽性者TPO水平下降明顯，該抗體可能通過中和TPO抑制巨核細胞增殖、成熟。TPO通過與巨核細胞膜表面特異性受體c-mpl結(jié)合促進巨核細胞成熟和生成血小板。而抗c-mpl抗體與c-mpl結(jié)合可抑制巨核細胞發(fā)育成熟，從而導(dǎo)致血小板生成減少[13]?？筩-mpl 抗體陽性患者血清TPO水平升高，可能與該抗體與TPO競爭結(jié)合c-mpl阻斷了TPO/c-mpl通路，使巨核細胞發(fā)育、成熟障礙，從而引起血小板減少[7]?？筎PO抗體及抗c-mpl抗體也可能通過抗原抗體間免疫反應(yīng)消耗了血小板或者通過殺傷骨髓巨核細胞影響血小板生成。具體機制還有待深入研究。

本研究進一步分析了抗TPO抗體、抗c-mpl抗體與除血小板減少外的其他臨床表現(xiàn)和實驗室指標的關(guān)系，結(jié)果顯示抗TPO抗體、抗c-mpl抗體陽性者均易出現(xiàn)皮疹，提示出現(xiàn)皮疹的SLE患者容易出現(xiàn)抗TPO抗體和抗c-mpl抗體?？筎PO抗體、抗c-mpl抗體陽性組與陰性組血清補體 C3及 C4、ESR、CRP、抗dsDNA陽性率、抗β2-GP1及SLEDAI 評分差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。另外本研究顯示SLE患者中抗TPO抗體與抗c-mpl抗體具有相關(guān)性，提示SLE患者兩抗體中任何一抗體陽性均易出現(xiàn)另一抗體陽性，兩抗體之間可能具有相互交叉的致病機制，具體機制有待進一步研究。

本研究對SLE伴血小板減少患者抗TPO抗體及抗c-mpl抗體作用做了初步探討，但其具體機制較復(fù)雜，需要通過擴大樣本量、多種檢測技術(shù)等進一步深入研究。TPO、TPO受體(c-mpl)及其抗體能否用于臨床病情預(yù)測、治療評估還需要進行大規(guī)模的研究證實，TPO受體激動劑及針對c-mpl及抗c-mpl抗體的生物制劑能否成為SLE血小板減少患者治療的新方向新靶點還有待進一步研究。