康冬柳 ，邢江峰 ，胡愛明 ，張付華 ，徐俊杰 ，文明華

（1.吉安市畜牧獸醫(yī)局，江西 吉安 343000；2.北京一立科技公司；3.九江市畜牧獸醫(yī)局；4.南昌市動物疫病預防控制中心；5.宜春市畜牧水產(chǎn)局；）

目前市級以下動物疫病預防控制機構由于設備、人員的缺乏，技術水平較低，造成多數(shù)動物疫病在基層不能及時檢測和診斷，有些疫病或樣本在基層無法開展病原學檢測，從而造成動物疫病的處置延遲和病原擴散，給養(yǎng)殖業(yè)造成損失甚至發(fā)生人畜共患病。因此，如何快速診斷動物疫病、“早快嚴小”控制動物疫情成為我們亟需解決的關鍵問題。

借鑒國內(nèi)外先進技術，我們探索建立了一套針對基層動物疫病檢測診斷的技術手段和解決方案，開發(fā)研究適合基層動物疫病檢驗診斷的技術平臺。技術平臺可根據(jù)具體地區(qū)研發(fā)不同疫病、項目的檢測試劑盒，簡化操作步驟和設備，靈敏度和操作性比現(xiàn)有試劑更優(yōu)。從而實現(xiàn)只需有PCR儀及常見設備、耗材，就能在市級以下動物疫病預防控制機構甚至養(yǎng)殖場、流動診斷車上都能開展病原學檢測的動物疫病診斷新局面。同時由于優(yōu)化了檢測方法，減少了操作步驟，具有實驗操作水平的工作人員可直接使用，或者沒有操作水平的工作人員可在極短期的培訓后可直接上崗，解決了實驗室專業(yè)人員不足的困難。

1 技術平臺簡介

隨著分子生物學相關領域的發(fā)展，實時熒光定量PCR(qPCR)技術也得到了越來越廣泛的應用。在遺傳病檢測、個體化用藥檢測、病原體檢測等領域qPCR技術已經(jīng)成為不可或缺的基本技術?，F(xiàn)在傳統(tǒng)的檢測方法是使用柱提法或磁珠法先從檢測樣本中將核酸提取出來，然后將提取好的核酸加入到配置好的PCR反應液里，這種傳統(tǒng)的熒光PCR方法需要人工干預的步驟較多，而且對實驗室的要求也高，整個反應流程需要4～6h。

我們建立的直擴qPCR技術平臺（POCT qPCR），使用1st TECH核酸定向釋放劑10min即可完成樣本中DNA和RNA的釋放，同時可將樣本中干擾qPCR反應效率的物質(zhì)凝固；釋放后的核酸樣本可以直接加入PCR反應液中進行反應，將qPCR檢測縮短至60min左右。

同時我們還建立了一種即用型qPCR的反應體系，省去了配置PCR反應液的實驗過程，與1st TECH核酸定向釋放劑配合使用可以使qPCR反應操作更簡單。

2 技術平臺優(yōu)勢

核酸提取方法和傳統(tǒng)的核酸提取方法的比較：

3 應用

3.1 我們將該技術平臺初步應用于動物H7N9的病原學監(jiān)測和篩查，完成監(jiān)測任務5 000余份次，具有設備簡化、步驟簡單、操作方便、靈敏度高等特點，非常適合市級以下基層動物疫病預防控制機構應用。

3.2 該技術平臺可用于多種類型樣本的檢測

①血液樣本：全血樣本、血清、血漿、指尖血；

②分泌物樣本：口腔拭子、咽拭子、肛拭子、生殖道分泌物或拭子、動物咽拭子；

③組織或細胞樣本：組織研磨上清液、細胞培養(yǎng)液、細菌或病毒培養(yǎng)物。

3.3 可根據(jù)具體地區(qū)、具體病種繼續(xù)研發(fā)不同疫病、項目的檢測試劑盒。

3.4 可用于樣本中RNA和DNA的檢測，國內(nèi)同類產(chǎn)品只能進行DNA的檢測。我們可以將傳統(tǒng)qPCR的檢測時間縮短至少1h以上，尤其適合于動物疫病的快速篩查，在最短的時間內(nèi)就可以將結果上報，為正確的處理疫情贏得了時間。