李 晨， 張 寧， 陳 斌， 李 蓉

(西北大學化工學院，陜西西安 710069)

氨羧類物質(zhì)是一種同時含有氨基和羧基的多齒類螯合劑，現(xiàn)已廣泛應用于金屬洗滌、日用洗滌、農(nóng)田施肥、食品、醫(yī)藥、檢測分析等行業(yè)，在人們的生產(chǎn)生活中發(fā)揮著不可替代的作用[1 - 5]。傳統(tǒng)的氨羧類螯合劑有亞氨基二乙酸(IDA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)以及氮三乙酸(NTA)等。但是這些螯合劑較難降解，會產(chǎn)生一定的積累效應，危害人體健康，且對環(huán)境造成不可逆的影響和破壞[6]。因此，生物可降解的氨羧類螯合劑是當前的發(fā)展趨勢，該類螯合劑對于創(chuàng)建環(huán)境友好型社會有著重要的意義[7]。近年來研究人員開發(fā)了一系列新的該類型螯合劑，如谷氨酸二乙酸(GLDA)、亞氨基二琥珀酸(IDS)、 羥乙基亞氨基二乙酸(HIDA)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)等。這些螯合劑普遍具有毒性低及使用安全的特點，其生物可降解性更是明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的螯合劑，是綠色化學品[8]。

氨羧類螯合劑作為配基可通過化學反應鍵合到硅膠單體上，得到氨羧類色譜填料[9]。該類填料可用于離子交換色譜(IEC)、高效配位離子色譜(HPCIC)以及固定金屬離子親和色譜(IMAC)等研究領域[10 - 13]。同時，氨羧類配基本身的性質(zhì)對該類色譜填料的性能有著重要的影響[14]。IDS是一個五齒的螯合劑，對大多數(shù)金屬離子具有較強的螯合力，尤其是對銅、鐵、錳、鎳等重金屬離子的螯合性能要優(yōu)于六齒的螯合劑EDTA[15 - 16]。此外，IDS在強堿、強酸以及中性環(huán)境下均能維持較好的穩(wěn)定性，具有無磷、無毒、無公害和生物可降解的特性[17 - 18]。目前，尚未見到IDS -硅膠色譜填料制備和應用的相關報道。

在本實驗中我們選擇IDS螯合劑為新的配基，硅膠為基質(zhì)，γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(γ-GLDP)為間隔臂，制備出一種新型綠色環(huán)保的IDS -硅膠色譜填料，并對其制備條件、鍵合量、色譜特性以及對金屬離子的螯合特性進行了研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

硅膠(粒度7 μm，孔徑30 nm，蘭州物理化學研究所)；γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(γ-GLDP，分析純，遼寧蓋縣化工研究所)；亞氨基二琥珀酸(IDS)(純度75%，石家莊德賽化工試劑有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(分析純，天津市華東試劑廠)；CuSO4·5H2O(分析純，天津市瑞金特化學品有限公司)；FeCl3·5H2O、NiCl2·6H2O、CoCl2·6H2O均為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司)；ZnCl2(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)；Ca(NO3)2·4H2O(分析純，天津市福晨化學試劑廠)；KH2PO4以及其他試劑均為分析純(西安化學試劑廠)；實驗用水為超純水。

1.2 IDS -硅膠固定相的制備

1.2.1硅膠的酸處理將10 g硅膠放入盛有50 mL 1.0 mol/L HCl的燒杯中，超聲震蕩2～3 min。過濾并用超純水洗至中性，將濕硅膠放入盛有100 mL 1.0 mol/L HNO3的圓底燒瓶中加熱回流1 h。冷卻溶液經(jīng)抽濾再用超純水洗至中性，90～110 ℃下干燥4 h后，待用。

1.2.2環(huán)氧硅膠的制備稱取經(jīng)酸處理后的干燥硅膠10 g，置于圓底燒瓶內(nèi)，加入200 mL 0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液(pH=4.0)，超聲2 min，逐滴加入10 mLγ-GLDP，在90 ℃下攪拌反應2 h。冷卻后過濾，并用超純水洗至中性后，干燥保存。

1.2.3IDS-硅膠固定相的制備取30 mL 1 mol/L Na2CO3，加入4.6 g IDS，溶解后調(diào)節(jié)pH至10.0～11.0，分別加入1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 g的環(huán)氧硅膠。在60～65 ℃下攪拌反應12 h。冷卻后過濾，并依次用超純水，10% HAc和超純水洗至中性,即可得到不同配比的IDS -硅膠固定相。

1.3 色譜柱的裝填

取上述不同配比的IDS -硅膠固定相,用20 mL異丙醇作溶劑混勻后，灌入裝填柱(50×4.6 mm i.d.)中，在400 kg壓力下自動裝填20 min[10]。

1.4 IDS鍵合量的測定

準確稱取干燥的不同比例的IDS -硅膠固定相(Silica∶IDS=1.0∶4.6、1.5∶4.6、2.0∶4.6、3.0∶4.6、4.0∶4.6)各1.0000 g，分別用pH=2.0的HCl浸泡12 h。抽濾后加入20 mL 超純水和5 mL 1 mol/L NaCl，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0。用0.01 mol/L NaOH標準溶液進行酸堿電位滴定，根據(jù)NaOH標準溶液的濃度和滴定所消耗的體積，計算出IDS的鍵合量。

1.5 色譜實驗

為了考察合成填料的陽離子交換特性，用IDS -硅膠柱對BSA、RNase和Lys三種標準蛋白混合物進行色譜分離實驗。條件如下，色譜柱：IDS -硅膠柱(50×4.6 mm i.d.)； 流動相：(A)0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=6.0)； (B) 0.02 mol/L PBS+0.5 mol/L NaCl(pH=6.0)； 線性梯度洗脫：20 min內(nèi)B的濃度從 0增加至100%；流速：1 mL/min；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL；每種標準蛋白的質(zhì)量濃度:2 mg/mL。

1.6 金屬離子的固定

以Fe3+的固定為例，將裝填好的IDS -硅膠柱連接于色譜系統(tǒng)。用水沖洗后，以0.5 mL/min流速用泵注入0.05 mol/L FeCl3的NaAc-HAc緩沖溶液(pH=5.0)，直至飽和。然后靜置25 min，依次用超純水和0.02 mol/L PBS 充分洗去未結(jié)合的金屬離子，再用超純水沖洗即可。用0.05 mol/L EDTA溶液洗下固定的Fe3+，依次換用CuSO4、NiCl2、ZnCl2、CoCl2和Ca(NO3)2的NaAc-HAc緩沖溶液(pH=5.0)，重復上述步驟，完成Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+和Ca2+等金屬離子的固定。

1.7 金屬離子鍵合量的測定

用0.05 mol/L EDTA溶液洗下IDS -硅膠固定相上的金屬離子，洗脫液收集在50 mL 容量瓶中，定容后以EDTA為空白，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-OES)測定IDS -硅膠固定相上金屬離子的鍵合量。

2 結(jié)果與討論

2.1 IDS -硅膠固定相的制備

氨羧類固定相通常是由基質(zhì)、間隔臂和氨羧類配體三部分組成。基質(zhì)通過間隔臂與配體偶合，這種偶合方式不僅可調(diào)節(jié)固定相的親水性，同時還可提高配體與生物大分子間的空間自由度。本研究中，我們以硅膠為基質(zhì)，γ-GLDP為間隔臂，IDS為配體。γ-GLDP一方面通過硅氧烷基在酸性條件下與硅膠偶合制得環(huán)氧硅膠(圖1)，另一方面通過環(huán)氧基在堿性條件下與IDS偶合。

圖1 環(huán)氧硅膠的制備路線Fig.1 Preparation route of epoxy-activated silica

然后按照硅膠與IDS的不同用量比(Silica∶IDS=1.0∶4.6、1.5∶4.6、2.0∶4.6、3.0∶4.6、4.0∶4.6)進行IDS -硅膠固定相的制備，合成路線見圖2。

圖2 IDS -硅膠固定相的制備路線Fig.2 Preparation route of IDS -Silica stationary phase

2.2 IDS鍵合量的測定

采用酸堿電位滴定的方法，測定了IDS在硅膠基質(zhì)上的鍵合量，從而篩選出IDS與硅膠的最佳鍵合配比。由IDS的分子結(jié)構(gòu)式可知，IDS是一種四元弱酸(pKa1=2.96±0.05，pKa2=3.84±0.02，pKa3=4.83±0.05，pKa4=10.12±0.04)[19]。由其離解常數(shù)Ka值可知，該弱酸中的4個質(zhì)子只有三個可被直接滴定，因此有三個等當點，但突躍重合。如圖3所示，不同配比固定相的滴定曲線均只有一個突躍。這一現(xiàn)象與上述理論推測相符。圖4給出了IDS在不同用量比IDS -硅膠固定相上的鍵合量。由實驗結(jié)果可知，不同配比下的IDS鍵合量不同。當環(huán)氧硅膠的用量為1.0 g時，IDS的鍵合量最??；硅膠與IDS用量比為1.5∶4.6時，IDS在環(huán)氧硅膠上的的鍵合量最大，為41.2 μmol/gIDS -硅膠；環(huán)氧硅膠的用量大于1.5 g時，隨著用量的增加，IDS的鍵合量反而降低。IDS在基質(zhì)上的鍵合量越大所制得的IDS -硅膠柱的離子交換特性以及金屬螯合特性就越顯著。故硅膠與IDS的最佳用量比為1.5∶4.6。

2.3 IDS -硅膠柱的陽離子交換特性

由IDS的分子結(jié)構(gòu)式(圖2)和離解常數(shù)Ka可知，IDS含有4個羧酸。在pH=6.0時，羧酸轉(zhuǎn)化為羧酸根，使IDS -硅膠柱帶負電荷，呈現(xiàn)出較強的陽離子交換特性。為了考察合成填料的陽離子交換特性，在IDS -硅膠(4.6∶1.5 g)柱上分別考察了BSA(pI=4.9)、RNase(pI=8.7)、Lys(pI=11.35)[14]的保留行為，結(jié)果如圖5所示。由圖5看出，按照線性梯度的洗脫方式，當流動相在20 min內(nèi)從100%A液變成100%B液時，隨著NaCl鹽濃度的增加，三種蛋白質(zhì)BSA、RNase和Lys在IDS -硅膠柱上得到了有效地分離。

圖3 不同比例IDS -硅膠固定相的滴定曲線Fig.3 Titration curves of IDS -Silica stationary phases with different proportions

圖4 IDS在不同比例IDS -硅膠固定相上的鍵合量Fig.4 Bonding amounts of IDS on IDS -Silica stationary phases with different proportions

圖5 蛋白質(zhì)混合物在IDS -硅膠柱上的色譜圖Fig.5 Chromatogram of protein mixture on IDS -Silica column1.BSA;2.RNase;3.Lys.Column:IDS -Silica column(50 × 4.6 mm i.d.).Mobile phase:A:0.02 mol/L PBS(pH=6.0);B:0.02 mol/L PBS+0.5 mol/L NaCl(pH=6.0).Gradient elution:B from 0 to 100% in 20 min.Flow rate:0.5 mL/min.Detector:UV(λ=280 nm).Size of sample:10 μL.Concentration of each protein:2 mg/mL.

其中，由于BSA的pI小于pH=6.0，故帶負電，因而不與帶負電的IDS -硅膠柱作用，表現(xiàn)為不保留及1 min內(nèi)流出。RNase和Lys按照pI遞增的順序依次流出，這是因為蛋白質(zhì)的pI越大，則蛋白質(zhì)的正電性就越強，與帶負電的IDS -硅膠柱間的靜電吸附就越強，因而更難洗脫。上述結(jié)果表明，制備的IDS -硅膠柱顯示出典型的陽離子交換特征。

2.4 IDS -硅膠柱的金屬螯合特性

IDS是一個含有N、O原子的五齒螯合劑(圖2)。IDS分子可向金屬離子同時提供5對孤對電子，展現(xiàn)出了對金屬離子的強螯合特性。為了考察IDS -硅膠柱的金屬螯合特性，在本研究中采用前沿色譜與ICP-OES相結(jié)合的方法，測定了Fe3+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+和Ca2+等金屬離子在IDS -硅膠柱上的鍵合量，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，IDS -硅膠填料與不同金屬離子鍵合時，金屬離子與配體IDS的鍵合量順序是：Fe3+>Cu2+>Ni2+>Zn2+>Co2+>Ca2+。金屬離子與配體鍵合量的大小與金屬離子的半徑和電荷數(shù)相關。通常金屬離子所帶電荷越多，半徑越小則中心離子的電場強度越大，越容易形成穩(wěn)定的螯合物[20]；當金屬離子具有相同電荷時，半徑越小，鍵合作用越強，與配體形成的螯合物越穩(wěn)定。Fe3+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+的離子半徑分別為64.5、69、72、74、74和100 pm，其中Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+均為二價金屬離子，因此半徑越小越有利于金屬離子的鍵合；與其他金屬離子不同，F(xiàn)e3+為三價，且半徑均小于其他金屬離子，故Fe3+與IDS的鍵合量最大。由此可知，實驗結(jié)果與理論分析相一致。此外，Cu2+與IDS的鍵合量明顯大于其它的氨羧類配體如亞氨基二乙酸(IDA)，L-谷氨酸(L-Glu)和L-天門冬氨酸(L-Asp)[21 - 22]。這一現(xiàn)象論證了IDS對金屬離子的強螯合特性。

表1 金屬離子在IDS -硅膠柱上的鍵合量(n=3)

3 結(jié)論

本文以IDS為配基，硅膠為基質(zhì)，γ-GLDP為間隔臂，合成出一種新型綠色環(huán)保的氨羧類色譜填料。通過電位滴定法確定出硅膠與IDS的最佳鍵合比為1.5∶4.6?？疾炝薎DS -硅膠柱的陽離子交換和金屬螯合的多功能特性。結(jié)果表明，制得的IDS -硅膠固定相具有優(yōu)良的離子交換特性和高強度的金屬螯合特性。