趙秋伶, 張振宇, 周廣原, 鄭 昊
(1.遼寧工程技術大學礦業(yè)技術學院,遼寧葫蘆島 125105;2.遼寧工程技術大學電子與信息工程學院,遼寧葫蘆島 125105)
恩諾沙星(Enrofloxacin,ENRX)是一種人工合成的氟喹諾酮類抗菌藥物[1],被廣泛用于畜牧生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中,預防和治療各種動物感染性疾病[2]。ENRX的大量使用造成其在動物源性食品中殘留,威脅人類的身體健康,如可引起神經(jīng)中毒、腎功能損傷、過敏反應等毒副作用,且有潛在的致癌作用,還會使病菌產(chǎn)生耐藥性[3 - 5]。世界各國均對喹諾酮類抗生藥的最高殘留限量(MRL)做出了嚴格限制。我國及美國均規(guī)定,牛、羊的脂肪與肌肉、奶、腎、肝中的MRL分別為100、100、200和300 μg/kg,豬、兔與家禽等其他動物的脂肪與肌肉、肝、腎中的MRL分別為100、200和300 μg/kg[6 - 7]。
目前文獻報道的ENRX殘留檢測方法主要有微生物法、色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、熒光法和分光光度法、毛細管電泳法和免疫學檢測法等[8 - 11]。免疫檢測方法具有快速、靈敏、準確、分析成本底、樣品前處理過程簡單等優(yōu)點,適合大樣品量篩查,因而在實際生產(chǎn)中得到廣泛的應用[12 - 13]?;诤怂徇m配體的酶聯(lián)分析法是一種新型的免疫分析方法[14],用核酸適配體代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗體發(fā)展檢測方法,可以進一步提高ENRX殘留檢測的靈敏度,另外核酸適配體不受外界環(huán)境的干擾,分析結果重現(xiàn)性高。本研究用自己篩選獲得的ENRX核酸適配體作為識別探針,建立了一種用于檢測動物源性食品中ENRX殘留的競爭取代酶聯(lián)分析方法。研制了ENRX酶聯(lián)分析試劑盒,為ENRX殘留檢測提供一種新的參考方法。
Spectra Max Paradigm多功能酶標儀(美國,Molecular Devices公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國,Millipore公司);Heal Force臺式高速冷凍離心機、微量可調(diào)移液器(德國,Eppendorf公司)。
恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、加替沙星、氯霉素、萊克多巴胺(純度>99%,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。ENRX核酸適配體序列,3′端生物素(biotin)標記:5′-GAAACGAGGTGCTTGACGGTACGATGTTATACCGGGTTAC-biotin-3′(A1);和A1部分互補的核酸序列,5′端異硫氰酸熒光素(FITC)標記:5′-FITC-ATTACCGTCAAGCACCTC-3′(B1);和B1完全互補的核酸序列:5′-biotin-GAGGTGCTTGACGGTAAT-3′(C1),均購自上海生工生物工程有限公司。Anti-FITC-HRP購自美國Millipore公司;鏈霉親和素修飾的酶標板和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液購自美國Thermo Scientific公司;恩諾沙星酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒,購自江蘇江萊ELISA研究所;其它試劑均為分析純。實驗用水為超純水。
試劑盒組成(96個反應/盒)見表1。使用方法如下:(1)固定DNA:首先向固定磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入A1 200 nmol/L和B1 500 nmol/L,于37 ℃孵育20 min形成部分互補的dsDNA。鏈霉親和素修飾的酶標板用200 μL磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBST)洗滌三次,每次5 min。然后在酶標板每孔加入100 μL含A1和B1的dsDNA溶液,置于37 ℃搖床,反應2 h。反應完畢移去反應液,凹槽用PBST洗滌三次,保留待用(凹槽1)。用相同的方法在另一鏈霉親和素修飾的酶標板的凹槽上固定DNA C1(C1的濃度為300 nmol/L),保留待用(凹槽2)。(2)檢測ENRX:ENRX用結合緩沖液稀釋成不同濃度,加入到待用凹槽1,每口100 μL,室溫反應30 min;反應完畢,用移液器吸出反應液轉(zhuǎn)移到待用凹槽2,37 ℃搖床反應20 min;然后移去反應液,用PBST洗滌三次,每次5 min,每口加100 μL anti-FITC-HRP,37 ℃反應30 min,移去反應液,洗滌三次,最后加100 μL TMB-H2O2底物顯色液,反應20 min,加25 μL 2 mol/L H2SO4終止反應。反應液由藍變黃,用酶標儀測450 nm波長處的吸光度。
表1 試劑盒的組成
(1)添加回收實驗:選取新鮮肌肉組織(高效液相色譜法已驗證無ENRX)作為添加回收實驗樣品。其前處理方法如下:稱取均質(zhì)后肌肉組織3份,每份各1 g,置于3個15 mL離心管中,分別添加25、50、100 ng ENRX標準品,靜置10 min后分別加入4 mL超純水,充分振蕩均勻,然后用離心機以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,分別吸取上層清液2 mL于3個10 mL離心管中,加入2 mL正己烷,振蕩10 min,以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,除去上層正己烷層,取下層清液50 μL待測。
(2)實際樣品檢測:從興城南關集貿(mào)市場采集鮮肉樣本,共30份,依照添加回收實驗的處理步驟處理鮮肉樣品。用研制的試劑盒進行檢測,同時用商用的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒做對照和驗證。
核酸適配體A1擁有40個堿基序列,前期的實驗已經(jīng)證明和ENRX作用的結合域包含在5′端的16個堿基里,而非后面的莖-環(huán)序列[15]?;贏1核酸適配體的結合域位于一端且不形成復雜結構的特點,我們設計了競爭取代酶聯(lián)分析檢測策略,見圖1。當A1的3′端生物素標記可以被固定到鏈霉親和素標記的酶標板上。B1共18個堿基,除了5′端的兩個堿基之外,其余16個堿基和A1中5′端的16個堿基互補配對,見圖1中A1和B1粗體部分。B1與A1能形成部分互補的dsDNA,通過雜交作用,B1也被固定到酶標板上。加入ENRX后,由于ENRX同其適配體的親和力大于雙鏈互補力,形成穩(wěn)定的ENRX/aptamer復合物,F(xiàn)ITC標記的B1自dsDNA上解離下來。取出含B1的溶液轉(zhuǎn)移到固定了C1的酶標板凹槽,通過雙鏈互補配對原則,B1被C1捕獲。FITC能捕獲帶HRP標簽的FITC抗體,HRP能催化TMB底物顯藍色,加入2 mol/L酸后藍色產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。
圖1 競爭取代酶聯(lián)適配體分析的示意圖Fig.1 Detection principle diagram of enzyme-linked aptamer assay with competition replacement mechanism
圖2 (A)檢測不同濃度ENRX的照片;(B)450 nm的紫外吸收與ENRX濃度的關系曲線(插圖(C)為(B)曲線中的線性部分)Fig.2 (A)Photographs of detecting different concentrations of ENRX;(B)Relationship between the UV absorption of 450 nm and the concentration of ENRX;(Inset:(C)is the linear part of (B) curve)The experimental conditions:[A1]=20 pmol/well,[B1]=50 pmol/well,[C1]=30 pmol/well,[ExoI]=5 U/well,[anti-FITC-HRP]=12.5 ng/well,[TMB]=1.2 mmol/L.The error bar represented the standard deviation of the three independent experiments.
在最優(yōu)的實驗條件下,競爭取代酶聯(lián)適配體分析試劑盒測定不同濃度ENRX的實驗結果見圖2。由圖2(A)照片可以看出,隨著ENRX濃度的增加,溶液的顏色逐漸加深。肉眼觀察的檢測限為200 nmol/L(相當于72.0 μg/kg)。相應的,從圖2(B)可以看出,隨著ENRX濃度的增加,A450吸光度不斷增大,開始時增加很快,后來趨于緩慢。在100~700 nmol/L(相當于35.9~251.6 μg/L)范圍內(nèi),在450 nm處的凈吸收值(A450-A450(blank))與ENRX的濃度呈良好的線性關系(圖2(C))。以信噪比大于3為可測信號標準,經(jīng)實驗得到ENRX的檢測限為75.0 nmol/L(相當于26.9 μg/L)。歐盟對ENRX在肌肉組織中的最大殘留限量(MRL)作出明確規(guī)定,要求不高于30 μg/kg。我國對動物源性食品中ENRX的要求是肌肉組織中ENRX的MRL不高于100 μg/kg。所以,研制的試劑盒可以滿足我國規(guī)定的檢測需求,也能滿足歐盟高標準檢測需求。
2.3.1添加回收實驗及精密度采用上述研制的酶聯(lián)適配體分析試劑盒,對豬肉、羊肉、魚肉進行檢測,分別添加25、50、100 ng/g 3個濃度水平的ENRX,取同一批次包被板,對同種樣品進行檢測,計算批內(nèi)變異系數(shù),再取不同批次的包被板,對同種樣品進行檢測,計算批間變異系數(shù),分別得到相同及不同批次樣品的精密度,結果見表2。由表2可知所建立方法對實際樣品檢測的準確度和精密度良好,符合檢測要求。
表2 鮮肉樣品添加回收實驗(n=5)
2.3.2特異性選擇諾氟沙星、加替沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、萊克多巴胺作為參照物,在相同測試條件下,當ENRX的濃度為1 μmol/L,而其它物質(zhì)濃度為10 μmol/L時,比較450 nm波長處的凈吸收值(凈吸收值=A450-A450(blank)),并計算交叉反應率P/N(P為對照物的凈吸收值,N為ENRX的凈吸收值)。由實驗結果可知,交叉反應率P/N均小于4%,與環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星的交叉反應率分別為3.46%、2.89%和2.33%,與其他結構類似物和功能類似物的交叉反應率均小于2%,說明除了加入恩諾沙星的體系外,其它體系檢測結果的凈吸收值都沒有明顯的提高(即使其它6個參照物濃度提高了10倍),表明該方法對ENRX的檢測具有較高的特異性。
2.3.3穩(wěn)定性試劑盒經(jīng)-20 ℃到室溫的反復凍融后的測試結果顯示,反復凍融60次后An/A0為0.86,0.86>0.8,說明檢測體系的凈吸收值沒有明顯變化,即試劑盒穩(wěn)定性良好。
2.3.4保存期限試劑盒保存前測得的凈吸收值為A0,試劑盒保存一段時間取出后測得的凈吸收值為Am,計算Am/A0,當Am/A0≤0.8時,認定試劑盒失效。由表3有效期試驗結果可知,試劑盒在37 ℃,保存一周失效。試劑盒在4 ℃可以保存半年以上,試劑盒在-20 ℃可保存3年。
表3 試劑盒有效期實驗結果
2.3.5成本分析試劑盒中的成分除了DNA和Anti-FITC-HRP都是常規(guī)試劑。就目前合成技術,DNA已能夠批量合成,合成2 OD用量時上去一個堿基10元左右,做96口反應需DNA 0.4~0.6 OD;100 μL Anti-FITC-HRP 395美元,做96口反應需2 μL足夠。再加上其它試劑,一個能做96口反應的試劑盒大約四百元,比市售的常規(guī)酶聯(lián)免疫分析試劑盒便宜。隨著DNA合成技術的進步,如果能在DNA上直接標記HRP,將不必使用Anti-FITC-HRP,還將大大降低成本。
應用本試劑盒檢測興城南關農(nóng)貿(mào)市場采集的30個鮮豬肉樣本,結果18個樣本檢出有ENRX殘留,其中5個樣本的殘留量在42.3~100.2 μg/kg之間,低于我國規(guī)定的最大殘留限量,13個樣本的殘留限量在101.3~182.0 μg/kg之間,高于我國規(guī)定的最高殘留限量。我們研制的試劑盒的檢測結果和商用的ELISA試劑盒檢測結果基本一致,ELISA試劑盒也檢出18個樣本有ENRX殘留,殘留量在40.1~158.4 μg/kg之間。說明研制的試劑盒可信度高,能用于檢測實際樣本中的ENRX殘留。
本文研制了ENRX的酶聯(lián)適配體分析檢測試劑盒,該試劑盒的檢測限為26.9 μg/L,線性檢測范圍為35.9~251.6 μg/L;應用于各樣品的添加回收率均落在93%~110%之間,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%;與結構類似物和功能類似物的交叉反應率都小于4%;在-20 ℃環(huán)境中,能保存3年以上,在4 ℃環(huán)境中,能保存6個月以上;穩(wěn)定性好,抵抗反復凍融至少60次。本文研制的試劑盒的靈敏度高、特異性強,具有準確、快速、簡便的優(yōu)點,能夠滿足動物源性食品中ENRX的快速篩查的需求。