楊明嫻 杜玉芬

（1 北京市第十四中學(xué) 北京 100055 2 北京教育學(xué)院宣武分院 北京 100053）

實(shí)驗(yàn)是生物學(xué)教學(xué)的重要內(nèi)容和基本手段，實(shí)驗(yàn)材料的選擇是否恰當(dāng)、安全，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否理想，是否有利于課堂教學(xué)目標(biāo)的有效達(dá)成，是中學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要原則之一。人教版高中生物學(xué)選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》模塊中設(shè)置了“微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)”這一實(shí)驗(yàn)課題。教材以采用大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行分離純化，希望學(xué)生熟練掌握微生物培養(yǎng)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)技能。作為高中實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)基本上是一學(xué)年進(jìn)行一次，實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌菌種不像大學(xué)實(shí)驗(yàn)室常年均可獲得，若不進(jìn)行保種，每年開展實(shí)驗(yàn)均需要從生物公司專門購(gòu)買菌種，費(fèi)用較高，存在實(shí)驗(yàn)材料不易獲取且實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)較高等問(wèn)題。特別是所用大腸桿菌菌種雖說(shuō)是安全菌種，但作為細(xì)菌，在高中實(shí)驗(yàn)室開展此實(shí)驗(yàn)，對(duì)于師生的安全性都存在一定的挑戰(zhàn)。鑒于此，對(duì)該實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行了改進(jìn)優(yōu)化，用酵母菌作為實(shí)驗(yàn)材料，取代傳統(tǒng)的大腸桿菌，能完成教材中要求的相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，且實(shí)驗(yàn)效果非常理想。改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)安全性極大提高，實(shí)驗(yàn)材料簡(jiǎn)單易得，較大程度降低了實(shí)驗(yàn)成本。

1 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

1）安琪高活性干酵母、土豆、葡萄糖、瓊脂、孟加拉紅培養(yǎng)基、75%酒精、蒸餾水。

2）接種環(huán)、玻璃涂布器、培養(yǎng)皿、錐形瓶、試管、試管架、膠塞、燒杯、量筒、玻璃棒、微量移液器、移液器吸頭、封口膜、橡皮筋、稱量紙、藥勺、酒精燈、火柴、記號(hào)筆。

3）電子天平、電磁爐、高壓蒸汽滅菌鍋、搖床、恒溫培養(yǎng)箱、微波爐、超凈工作臺(tái)（可用酒精燈代替）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試劑的配制

1）5%的葡萄糖溶液：稱取5g葡萄糖，溶于100 mL蒸餾水中。

2）馬鈴薯液體培養(yǎng)基：土豆去皮后稱取200 g，切成小塊放入鍋中，加水1 000 mL，加熱煮沸，煮至土豆軟爛，用紗布過(guò)濾取汁，再加入20 g葡萄糖溶解，用蒸餾水定容至1 000 mL。

3）馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基：在上述馬鈴薯液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入1.5%的瓊脂粉（瓊脂粉因生產(chǎn)廠家不同其強(qiáng)度不同，可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整比例）。

4）孟加拉紅培養(yǎng)基：按如下配方配制，也可直接購(gòu)買成品：蛋白胨 5 g；葡萄糖 10 g；磷酸二氫鉀 1 g；硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g；瓊脂 15 g；1/3000孟加拉紅溶液100 mL；蒸餾水1 000 mL；氯霉素0.1 g

以上試劑均需高壓蒸汽滅菌（壓力103 kPa，溫度121℃）后方可使用。本實(shí)驗(yàn)所需的其他物品也均需高壓蒸汽滅菌。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)步驟按照?qǐng)D1流程開展。

2.2.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需物品、配制相關(guān)試劑及培養(yǎng)基（見2.1試劑的配制）并滅菌。待滅好菌的培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程

2.2.2 酵母菌的活化 在酒精燈火焰旁打開袋裝安琪高活性干酵母，取少量酵母粉末加入至已滅菌的5%葡萄糖溶液中，置于28℃搖床上震蕩培養(yǎng)活化3～10 h（培養(yǎng)時(shí)間可根據(jù)接種量的多少適當(dāng)調(diào)整），也可直接采用室溫活化，觀察錐形瓶中酵母菌培養(yǎng)液渾濁度的變化，待液體渾濁時(shí)即可。

2.2.3 酵母菌的顯微鏡觀察 在酒精燈火焰前取適量活化后的酵母菌，制作臨時(shí)裝片，在顯微鏡下鏡檢，觀察酵母菌形態(tài)。

2.2.4 接種

1）平板劃線法接種。在酒精燈火焰旁，用已灼燒滅菌并冷卻后的接種環(huán)，蘸取一環(huán)菌液，在培養(yǎng)基上劃3～5條平行線，然后灼燒接種環(huán)，冷卻，從第1區(qū)域劃線的末端開始往第2區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，注意不要將最后一區(qū)的劃線與第1區(qū)相連（也可采用連續(xù)“之”字劃線法接種）。做好標(biāo)記，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察是否出現(xiàn)單菌落，并記錄菌落的顏色、形狀、大小等特征。

2）稀釋涂布平板法接種。將酵母菌菌液進(jìn)行梯度稀釋（101～106），用微量移液器移取 100 μL 106倍稀釋的菌液，接種到培養(yǎng)基表面（接種選取的稀釋倍數(shù)可根據(jù)情況適當(dāng)調(diào)整），用滅菌的玻璃涂布器涂布均勻。做好標(biāo)記，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2.5 純化 無(wú)菌挑取分離得到的單菌落，并接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，放在28℃搖床上震蕩培養(yǎng)8～12 h，待培養(yǎng)液渾濁渾濁度適當(dāng)時(shí)停止培養(yǎng)，即可得到酵母菌的純培養(yǎng)液。

2.2.6 初步鑒別 將酵母菌菌液接種到孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基中，酵母菌呈現(xiàn)紅色菌落。

2.2.7 保種 取酵母菌純培養(yǎng)液800 μL于1.5 mL的無(wú)菌離心管中，加200 μL無(wú)菌甘油，混勻，冷凍保存。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 酵母菌的活化 采用不同的活化方式與活化時(shí)間，酵母菌活化結(jié)果見表1。

表1 酵母菌的活化

由表1可知，15℃室溫活化1 h與 28℃恒溫振蕩活化1 h并無(wú)太大區(qū)別，而恒溫振蕩活化7 h酵母菌數(shù)量明顯上升，可達(dá)1.6×1010個(gè)/mL，在真正開展此實(shí)驗(yàn)時(shí)，可根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的活化方式與時(shí)間。15℃室溫活化1 h即可保證實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需求。所以，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)，完全可采用最簡(jiǎn)便的室溫活化方式進(jìn)行。

3.2 酵母菌的顯微鏡觀察 用顯微鏡鏡檢可觀察到活化了的酵母菌，具有細(xì)胞典型的形態(tài)，并有一定的折光度，在視野中還可捕捉到正在進(jìn)行出芽生殖的酵母菌（圖2）。

圖2 酵母菌的顯微鏡鏡檢結(jié)果（放大倍數(shù)10×40）

3.3 接種

3.3.1 平板劃線法接種 平板劃線法采用教材中的分區(qū)劃線，以及連續(xù)劃“之”字的方式分別接種，2種接種方法均可分離得到單個(gè)菌落（圖3）。

圖3 平板劃線法接種酵母菌（左：分區(qū)劃線 右：連續(xù)劃線）

3.3.2 稀釋涂布平板法接種 本實(shí)驗(yàn)中，酵母菌菌液采用28℃恒溫振蕩活化7 h的菌液，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）可知，107倍稀釋的菌液在本實(shí)驗(yàn)中是較理想的稀釋度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，該稀釋度下酵母菌菌落數(shù)為160個(gè)，在30～300個(gè)范圍內(nèi)，符合微生物的計(jì)數(shù)要求，換算得到酵母菌菌液的濃度為 1.6×1010個(gè)/mL。

圖4 稀釋涂布平板法接種酵母菌

酵母菌接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無(wú)論是平板劃線法還是稀釋涂布平板法，均可分離得到單個(gè)菌落，與大腸桿菌菌落形態(tài)類似，且均較為規(guī)則，邊緣較整齊，不同于大腸桿菌的是酵母菌菌落通常比較鼓，有突起，大腸桿菌菌落則相對(duì)比較平整，這也可作為菌種初步鑒別的一個(gè)依據(jù)。此外，酵母菌培養(yǎng)時(shí)間也相對(duì)較快，一般培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)就明顯可見，在開展教學(xué)時(shí)，第1天做實(shí)驗(yàn)，第2天觀察結(jié)果，課時(shí)銜接非常順利，即便是多培養(yǎng)2天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不會(huì)有太大影響，菌落更大反而更便于觀察。

3.4 純化 用無(wú)菌接種環(huán)或無(wú)菌牙簽挑取一個(gè)單菌落，并接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，放在28℃搖床上振蕩培養(yǎng)，獲取酵母菌的純培養(yǎng)液。

3.5 初步鑒別 教材中對(duì)大腸桿菌的初步鑒別采用伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基上大腸桿菌呈現(xiàn)金屬光澤。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)孟加拉紅培養(yǎng)基可用于酵母菌的初步鑒別。酵母菌在該培養(yǎng)基上會(huì)呈現(xiàn)出紅色菌落（圖5）。

圖5 酵母菌的初步鑒別

3.6 保種 為使實(shí)驗(yàn)課題相對(duì)比較完整，以及讓學(xué)生了解微生物培養(yǎng)中保種的方法和意義，又進(jìn)行了保種的操作，將純化后的酵母菌菌液800 μL與200 μL無(wú)菌甘油混勻，-20℃冷凍保存即可。其實(shí)，在實(shí)際操作中完全可省略此環(huán)節(jié)。酵母菌的活化非常方便，只要在開展實(shí)驗(yàn)前，購(gòu)買一袋安琪高活性干酵母，用5%葡萄糖溶液室溫活化1～3 h即可，隨用隨活化，免去了以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)材料必須每年保種的繁瑣。

4 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)后的優(yōu)點(diǎn)

4.1 實(shí)驗(yàn)安全性極大提高 以酵母菌作為實(shí)驗(yàn)材料，取代傳統(tǒng)的大腸桿菌，改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)材料菌種來(lái)源于生活中食用干酵母，相比大腸桿菌安全性方面極大提高，保證了師生的實(shí)驗(yàn)安全。

4.2 實(shí)驗(yàn)材料簡(jiǎn)單易得 原教材中必須有大腸桿菌菌種才可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，且每年都需進(jìn)行保種，否則無(wú)法維持實(shí)驗(yàn)教學(xué)的運(yùn)轉(zhuǎn)，若保存不當(dāng)還會(huì)出現(xiàn)無(wú)法開展實(shí)驗(yàn)的不利局面。而酵母菌菌種的獲取非常方便，只需在開展實(shí)驗(yàn)時(shí)買一袋干酵母，用適量已滅菌的5%葡萄糖溶液活化即可獲取酵母菌菌種，且無(wú)需保種，可隨時(shí)活化。此外，本實(shí)驗(yàn)需用土豆配制培養(yǎng)基，所用實(shí)驗(yàn)材料都貼近生活、價(jià)格便宜，也便于學(xué)生接受，符合學(xué)生的認(rèn)知。

4.3 極大程度降低了實(shí)驗(yàn)成本 對(duì)原實(shí)驗(yàn)和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)所需成本進(jìn)行比較，按照1 L培養(yǎng)基用量，每升培養(yǎng)基可倒約50～60個(gè)平板，能滿足一個(gè)班級(jí)分組實(shí)驗(yàn)的使用量，僅1個(gè)教學(xué)班就可節(jié)省150多元，平行班越多，節(jié)約的成本也越多。

總之，用酵母菌作為實(shí)驗(yàn)材料，取代傳統(tǒng)的大腸桿菌，能完成教材中“微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)”要求的所有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，且實(shí)驗(yàn)效果非常理想，成本較低，可作為實(shí)驗(yàn)教學(xué)的推廣。