高效液相色譜法測(cè)定鮭魚降鈣素鼻噴劑中苯扎氯銨的含量

周朝東，黃哲甦

(天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070)

鮭魚降鈣素鼻噴劑適用于治療骨質(zhì)疏松癥、由于骨質(zhì)溶解或骨質(zhì)減少引起的骨痛以及高血鈣癥等。經(jīng)查閱，《中國(guó)藥典》2015年版、《美國(guó)藥典》41版、《歐洲藥典》9.0版、《英國(guó)藥典》2018年版及日本藥局方17版中均未收載鮭魚降鈣素鼻噴劑。搜索國(guó)家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站，目前國(guó)內(nèi)有2家企業(yè)有鮭魚降鈣素鼻噴劑批準(zhǔn)文號(hào)，分別是銀谷制藥有限公司和深圳大佛藥業(yè)股份有限公司。國(guó)外只有Novartis(諾華)制藥有限公司有批準(zhǔn)文號(hào)。由于鼻噴劑為多劑量噴霧劑，故按照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0106和0112的要求，除非制劑本身有足夠的抑菌性能，否則應(yīng)添加適宜濃度的抑菌劑。苯扎氯銨又名潔兒滅，是具有殺菌作用的季銨鹽類陽(yáng)離子表面活性劑，是氯化二甲基芐基烴銨的混合物，其殺菌特性源于季銨離子和烷烴鏈。季銨離子在水中帶正電荷，可以吸附于帶負(fù)電荷的微生物表面形成微團(tuán)，并逐步滲入細(xì)胞漿的類脂層，從而改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)容物外滲，阻礙其代謝，從而起到殺滅微生物的作用[1]。目前，苯扎氯銨作為抑菌劑被廣泛應(yīng)用于各類制劑中，因此有必要對(duì)其含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。本文建立了鮭魚降鈣素鼻噴劑中苯扎氯銨含量測(cè)定的高效液相色譜法，以苯扎氯銨n-C10H21、n-C12H25、n-C14H29和n-C16H33取代同系物峰面積之和計(jì)算含量，方法簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可以應(yīng)用于鮭魚降鈣素鼻噴劑中苯扎氯銨的含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津LC-20A型高效液相色譜儀，SPD-20A紫外檢測(cè)器，LCsolution色譜工作站(日本島津公司)； METTLER XS205型十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2試藥 苯扎氯銨含量測(cè)定用對(duì)照品由LGC生產(chǎn)，批號(hào)82370，純度91.6%；鮭魚降鈣素對(duì)照品由企業(yè)提供，批號(hào)為H6091；3批鮭魚降鈣素鼻噴劑為本科室留樣,由瑞士諾華制藥企業(yè)生產(chǎn),批號(hào)分別為H5096A，H5098和H5095A；五水合四甲基氫氧化銨購(gòu)自sigma公司，批號(hào)為MKBX6732V。其余試劑均為分析純,水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：waters μBondpak?CN 125?色譜柱(150 mm×3.9 mm，10 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水-四甲基氫氧化銨(475 ml∶525 ml∶1.99 g，磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)；流速：0.6 ml/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：50 μl；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。由LCsolution軟件計(jì)算得知，C10-苯扎氯銨與C12-苯扎氯銨峰之間的分離度為2.2，C12-苯扎氯銨與C14-苯扎氯銨峰之間的分離度為3.0，C14-苯扎氯銨與C16-苯扎氯銨峰之間的分離度為4.1，符合《中國(guó)藥典》要求(大于1.5)。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苯扎氯銨對(duì)照品約100 mg置100 ml量瓶中，用稀釋液(取氯化鈉0.850 g，加水使溶解成100 ml，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.7，即得)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為苯扎氯銨對(duì)照品貯備液。精密量取5 ml置50 ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，即得，此時(shí)苯扎氯銨對(duì)照品濃度約為0.1 mg/ml，平行制備2份對(duì)照品。

2.2.2供試品溶液的制備 取供試品溶液直接進(jìn)樣分析。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備 按鮭魚降鈣素鼻噴劑的處方稱取除苯扎氯銨外的成分配制成溶液，然后進(jìn)樣分析。

2.3專屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各50 μl ，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。由圖1可知，陰性對(duì)照溶液在苯扎氯銨出峰處均沒有干擾峰出現(xiàn)，因此，鼻噴劑中其他成分、稀釋液以及流動(dòng)相對(duì)苯扎氯銨的含量測(cè)定均沒有干擾。

2.4線性關(guān)系考查 精密稱取苯扎氯銨對(duì)照品約50 mg置50 ml量瓶中，用稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液貯備液；分別精密量取2.5、4、5、6和7.5 ml置50 ml量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，即得，其濃度范圍從45.525 2～136.575 6 μg/ml，相當(dāng)于供試品溶液標(biāo)示濃度的約50%～150%。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以苯扎氯銨濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，回歸方程為：Y=38 299 906X-18 967 467(r=1.000 0)，苯扎氯銨濃度在45.525 2～136.575 6 μg/ml內(nèi)，其濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系。

1.C10-苯扎氯銨 2.C12-苯扎氯銨

2.5精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下苯扎氯銨對(duì)照品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，峰面積的RSD為0.17%，表明儀器精密性良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為H5096A的供試品5份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定分析，結(jié)果5份供試品的苯扎氯銨含量平均值為0.092 mg/ml，RSD為0.06%，表明供試品的重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液1份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8和24 h各進(jìn)樣2針。結(jié)果，供試品溶液中的苯扎氯銨在24 h內(nèi)峰面積的RSD為0.12%，表明苯扎氯銨溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8回收率試驗(yàn) 按鮭魚降鈣素鼻噴劑處方精密稱取鮭魚降鈣素對(duì)照品和氯化鈉適量置50 ml量瓶中，平行制作9份。然后分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下苯扎氯銨對(duì)照品貯備液4、5和6 ml置上述50 ml量瓶中，用鹽酸溶液(pH 3.7)溶解并稀釋至刻度，制成每1 ml含苯扎氯銨0.08、0.1和0.12 mg的溶液，每個(gè)加樣濃度平行做3份，共9份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果，9份樣品的平均回收率為99.4%，RSD為0.69%。見表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.9檢出限和定量限試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下苯扎氯銨對(duì)照品溶液進(jìn)行稀釋，并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以信噪比S/N=3作為最低檢出限，以信噪比S/N=10作為定量限。結(jié)果，最低檢出濃度為8.19 ng/ml，檢出限為0.4 ng；最低定量濃度為27.3 ng/ml，定量限為1.4 ng。

2.10苯扎氯銨含量計(jì)算公式 苯扎氯銨(mg/ml)=C對(duì)×

2.11供試品中苯扎氯銨測(cè)定結(jié)果 取3批供試品按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰峰面積，然后按照“2.9”項(xiàng)下計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 供試品中苯扎氯銨測(cè)定結(jié)果

3 討論

苯扎氯銨由于其神經(jīng)毒副作用小、抑菌作用強(qiáng)，被廣泛地添加至消毒劑、健康護(hù)理液、化妝品、滴眼液和滴鼻液中[2]。苯扎氯銨原料及其溶液在《中國(guó)藥典》2015年版[3]、《美國(guó)藥典》41版[4]、《歐洲藥典》9.0版[5]和《英國(guó)藥典》2018年版[6]均有收載。 《中國(guó)藥典》2015年版二部收載的苯扎氯銨原料僅規(guī)定本品為氯化二甲基芐基烴銨的混合物，按無(wú)水物計(jì)算，含烴銨基應(yīng)為95.0%～105.0%，未對(duì)苯扎氯銨各取代同系物組成及其比例作出規(guī)定?！睹绹?guó)藥典》41版、《歐洲藥典》9.0版和《英國(guó)藥典》2018年版則對(duì)苯扎氯銨各取代同系物組成及其比例作出規(guī)定且限度要求均為C12同系物不低于40%，C14同系物不低于20%，二者之和不低于70%。《美國(guó)藥典》41版、《歐洲藥典》9.0版和《英國(guó)藥典》2018年版在苯扎氯銨各取代同系物組成測(cè)定方法上大致相同，略有差異。相同之處為：①均采用高效液相色譜法，配合紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)均為254 nm；②色譜柱均為氰基鍵合硅膠色譜柱，流速均為2 ml/min；③流動(dòng)相均為乙腈-0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)；④對(duì)照品和供試品的濃度均為4 mg/ml。不同之處主要有3點(diǎn)：①進(jìn)樣量不同，《美國(guó)藥典》41版進(jìn)樣量為20 μl，《歐洲藥典》9.0版和《英國(guó)藥典》2018年版進(jìn)樣量則是10 μl。②系統(tǒng)適用性要求不同，《美國(guó)藥典》41版要求C12同系物與C14同系物之間的分離度應(yīng)不小于1.5，此外還要求C12同系物峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不低于2.0%。而《歐洲藥典》9.0版和《英國(guó)藥典》2018年版則只規(guī)定了C12同系物與C14同系物之間的分離度不小于1.5。③《美國(guó)藥典》41版還提供了C10同系物的相對(duì)保留時(shí)間(相對(duì)C12同系物為0.9)和平均分子量(312)，而《歐洲藥典》9.0版和《英國(guó)藥典》2018年版只提了C12、C14和C16同系物的分子量，未提及C10同系物。

對(duì)于含量測(cè)定，《中國(guó)藥典》2015年版、《美國(guó)藥典》41版、《歐洲藥典》9.0版和《英國(guó)藥典》2018年版均采用滴定法，先精密加入碘化鉀溶液與苯扎氯銨反應(yīng)，再用碘酸鉀滴定液滴定剩余的碘化鉀溶液，結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。《中國(guó)藥典》2015年版與國(guó)外藥典有三處異同：一是限度不同，《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定限度為以無(wú)水物計(jì)算，含烴銨基應(yīng)為95.0%～105.0%?！睹绹?guó)藥典》41版規(guī)定限度為按無(wú)水物計(jì)算，應(yīng)為97.0%～103.0%，《歐洲藥典》9.0版和《英國(guó)藥典》2018年版限度則為按無(wú)水物計(jì)算，應(yīng)為95.0%～104.0%；二是萃取劑不同，《中國(guó)藥典》2015年版采用三氯甲烷作為萃取劑，而《美國(guó)藥典》41版、《歐洲藥典》9.0版和《英國(guó)藥典》2018年版則采用二氯甲烷作為萃取劑；三是滴定度的表述不同， 《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定每1 ml碘酸鉀滴定液(0.05 mol/L)相當(dāng)于35.40 mg的C22H40ClN。而《美國(guó)藥典》41版、《歐洲藥典》9.0版和《英國(guó)藥典》2018年版則規(guī)定每1 ml碘酸鉀滴定液(0.05 mol/L)相當(dāng)于X/10 mg的苯扎氯銨，X是平均相對(duì)分子量。

由于不同廠家生產(chǎn)的苯扎氯銨同系物組成不同，而苯扎氯銨不同取代同系物的抑菌譜又有差異[7]，因此，有必要對(duì)苯扎氯銨的同系物組成及其比例進(jìn)行質(zhì)量控制，而本文建立的高效液相色譜法操作簡(jiǎn)單快速，方法準(zhǔn)確，可以應(yīng)用于鮭魚降鈣素鼻噴劑中防腐劑苯扎氯銨的含量測(cè)定。