陳丹妍，蔡雅雯，黃煒雅，王玉嬋，王 妍

(細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108)

鼠傷寒沙門氏菌作為一種人畜共患病最為常見(jiàn)的病原菌之一，由于其耐藥性極速形成，多重耐藥沙門氏菌分離株出現(xiàn)并迅速傳播，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)的發(fā)展，對(duì)公共衛(wèi)生造成了日益嚴(yán)重的影響[1]。因此消毒劑被廣泛地用于沙門氏菌疾病的防治，是食品生產(chǎn)清洗、消毒過(guò)程中使用的主要化合物[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，消毒劑通常攻擊多個(gè)部位，整體損傷才會(huì)產(chǎn)生殺菌效果[4]。自1935年德國(guó)人Domagk[5]發(fā)現(xiàn)烷基二甲基氯化銨的殺菌作用以來(lái)，季銨鹽類抗菌劑的劑型和消毒效果研究一直是消毒領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。與傳統(tǒng)次氯酸鈉、雙氧水等常用氧化型消毒劑相比，季銨鹽消毒劑具有毒性低、高水溶性、刺激性小和存儲(chǔ)使用方便的優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛應(yīng)用在日常生產(chǎn)生活中[6]。

苯扎氯銨(Benzalkonium chlorides，BACS)消毒劑作為常用的季銨鹽消毒劑之一，同時(shí)也是一種陽(yáng)離子表面活性劑，通過(guò)破壞脂質(zhì)膜雙層發(fā)揮作用，可有效對(duì)抗幾種光生微生物，尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌[7]。眼部感染的細(xì)菌大多都為革蘭氏陽(yáng)性菌，例如肺炎鏈球菌、表皮葡萄球菌及金黃色葡萄球菌等[8]，所以一般會(huì)在滴眼液中添加抑菌劑苯扎氯銨。常見(jiàn)的氯化鈉滴眼液主要成分為氯化鈉，其中加入了苯扎氯銨，還含有玻璃酸鈉等成分，主要用于緩解眼睛疲勞引起的局部干澀[9]。使用氯化鈉作為滴眼液的主要成分，主要是因?yàn)槠渑c人體生理環(huán)境最為接近，但是否能使苯扎氯銨抑菌效果達(dá)到最好，還未有明確的證據(jù)，可能存在其他介質(zhì)能使苯扎氯銨發(fā)揮更好的作用也未可知。

在很長(zhǎng)一段時(shí)間里，基于細(xì)菌不能同時(shí)形成多種耐藥性機(jī)制的假設(shè)，對(duì)消毒劑或消毒劑的耐藥性并沒(méi)有引起人們的重視[10]。然而，在三氯生這一常用陽(yáng)離子消毒劑的具體耐藥機(jī)理被報(bào)道后[11-12]，對(duì)季銨鹽等其他陽(yáng)離子劑的耐藥機(jī)理的重新評(píng)價(jià)引起了研究者們的極大關(guān)注[13]。盡管苯扎氯銨的殺菌機(jī)制是非特異性的[14]，但已經(jīng)出現(xiàn)了耐性突變體，這表明細(xì)菌的適應(yīng)性，尤其是沙門氏菌、李斯特菌和大腸桿菌[15]。例如，苯扎氯銨廣泛用于農(nóng)牧業(yè)的消毒以及食品行業(yè)的表面、器具和儀器消毒，這導(dǎo)致鼠傷寒沙門氏菌已經(jīng)對(duì)苯扎氯銨逐漸產(chǎn)生耐藥性[1]。

為了減緩鼠傷寒沙門氏菌對(duì)苯扎氯銨的耐藥性，因此本試驗(yàn)開始探究苯扎氯銨殺滅鼠傷寒沙門氏菌效果最好的條件，首先在ddH2O和0.9% NaCl介質(zhì)中做了嘗試，發(fā)現(xiàn)在0.9% NaCl介質(zhì)中會(huì)抑制苯扎氯銨的殺菌效果。隨后在6種不同介質(zhì)中進(jìn)行驗(yàn)證，再通過(guò)添加8種不同的氨基酸進(jìn)行試驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)是介質(zhì)中解離的陰離子會(huì)抑制其殺菌效果。為了排除菌種特異性，在典型的耐藥菌肺炎克雷伯氏菌及金黃色葡萄球菌中也驗(yàn)證了這一現(xiàn)象。通過(guò)本研究結(jié)果，期望能最大限度地發(fā)揮苯扎氯銨的作用，并減緩細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生的耐藥性，減輕農(nóng)牧業(yè)發(fā)展的負(fù)擔(dān)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株：鼠傷寒沙門氏菌SL1344、肺炎克雷伯氏菌KP-D367、金黃色葡萄球菌ATCC25923，由細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試驗(yàn)藥品與儀器

試劑藥品：苯扎氯銨(BACS)、氯化鈉(NaCl)、二甲基亞砜(DMSO)、葡萄糖(Glucose)、正丁醇(1-Butanol)、氯化鉀(KCl)、氯化鈣(CaCl2)、氯化鎂(MgCl2)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)。以上藥品配制成溶液后均經(jīng)過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾確保無(wú)菌后備用。

試劑藥品及使用濃度：BACS儲(chǔ)液(25 mg·mL-1)、NaCl(0.9%)、DMSO(1%)、Glucose(10 mmol·L-1)、1-Butanol(0.3 mol·L-1)、KCl(100 mmol·L-1)、CaCl2(100 mmol·L-1)、MgCl2(100 mmol·L-1)、8種氨基酸Leu/Met/Cys/Gly/Asp/Glu/Lys/Arg(10 mg·mL-1) 。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1菌種活化及稀釋點(diǎn)板方法 (1)活化菌種。取-80℃凍存的細(xì)菌菌液2 μL，加入到1 mL LB液體培養(yǎng)基中，于搖床(37℃、220 r·min-1)過(guò)夜培養(yǎng)進(jìn)行菌種活化，所得菌液以1∶500的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，于搖床(37℃、220 r·min-1)培養(yǎng)24 h，即得平臺(tái)期細(xì)菌菌液。(2)稀釋點(diǎn)板。處理并洗滌后的所得菌液按每次10倍的梯度用PBS緩沖液稀釋，稀釋梯度為101、102、103、104、105，每個(gè)稀釋度取4 μL菌液點(diǎn)在LB固體培養(yǎng)基平板上，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱12 h后，檢查細(xì)菌死亡并進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)菌經(jīng)處理后的存活率。

1.3.2苯扎氯銨在ddH2O和0.9% NaCl介質(zhì)中殺滅平臺(tái)期鼠傷寒沙門氏菌效果的差異 取平臺(tái)期鼠傷寒沙門氏菌50 μL的菌液離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，單處理組分別用100 μL ddH2O和0.9% NaCl溶液重懸菌體，雙處理組分別用100 μL含苯扎氯銨的ddH2O和0.9% NaCl溶液重懸菌體，苯扎氯銨終濃度分別設(shè)定為40、50、60、70、80 μg·mL-1，處理時(shí)間設(shè)定為3 min。處理時(shí)間結(jié)束后立即離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS緩沖液重懸菌體，洗滌2次后，再加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體。

1.3.3在6種不同介質(zhì)中驗(yàn)證苯扎氯銨殺滅平臺(tái)鼠傷寒沙門氏菌效果的差異 發(fā)現(xiàn)在ddH2O和0.9% NaCl介質(zhì)中苯扎氯銨的殺菌效果存在很大的差異后，首先分析了ddH2O與0.9% NaCl的化學(xué)性質(zhì)，再結(jié)合苯扎氯銨的成分及殺菌機(jī)制，猜想可能是由于NaCl會(huì)在溶液中解離成Na+和Cl-，溶液中存在的離子會(huì)抑制苯扎氯銨的殺菌效果。因此隨機(jī)挑選了2大類共6種介質(zhì)，第1類是DMSO、葡萄糖及正丁醇，在溶液中不會(huì)解離；第2類是KCl、CaCl2及MgCl2，在溶液中會(huì)發(fā)生解離。

取平臺(tái)期鼠傷寒沙門氏菌50 μL的菌液離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，單處理組分別用100 μL含1% DMSO、10 mmol·L-1Glucose、0.3 mol·L-11-Butanol、100 mmol·L-1KCl、100 mmol·L-1CaCl2、100 mmol·L-1MgCl2的水溶液重懸菌體，雙處理組分別用100 μL含苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+1% DMSO、苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+10 mmol·L-1Glucose、苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+0.3 mol·L-1正丁醇、苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+100 mmol·L-1KCl、苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+100 mmol·L-1CaCl2、苯扎氯銨(60 μg·mL-1)+100 mmol·L-1MgCl2的水溶液重懸菌體，處理時(shí)間設(shè)定為3 min。處理時(shí)間結(jié)束后立即離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS緩沖液重懸菌體，洗滌2次后，再加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體。

1.3.4添加8種不同氨基酸驗(yàn)證苯扎氯銨殺菌受到陰離子(負(fù)電)的抑制 發(fā)現(xiàn)苯扎氯銨在溶液中會(huì)解離的介質(zhì)里殺菌效果會(huì)受到很大的抑制，但僅驗(yàn)證了是解離的離子影響了苯扎氯銨的殺菌效果，是溶液中的陽(yáng)離子還是陰離子影響更大有待研究。因此隨機(jī)挑選了4大類共8種氨基酸，第1類是非極性氨基酸中的亮氨酸和甲硫氨酸，第2類是極性不帶電氨基酸中的半胱氨酸和甘氨酸，第3類是極性帶正電氨基酸中的精氨酸和賴氨酸，第4類是極性帶負(fù)電氨基酸中的天冬氨酸和谷氨酸。通過(guò)在水溶液中分別添加這8種氨基酸，作為苯扎氯銨的殺菌介質(zhì)，開展了本階段的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證是陽(yáng)離子還是陰離子抑制苯扎氯銨的殺菌效果。

取平臺(tái)期鼠傷寒沙門氏菌50 μL的菌液離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，單處理組分別用100 μL含10 mg·mL-1亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸的水溶液重懸菌體，雙處理組分別用100 μL含60 μg·mL-1苯扎氯銨的亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸的水溶液重懸菌體，處理時(shí)間設(shè)定為3 min。處理時(shí)間結(jié)束后立即離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS緩沖液重懸菌體，洗滌2次后，再加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體。

1.3.5在平臺(tái)期肺炎克雷伯氏菌及金黃色葡萄球菌中驗(yàn)證介質(zhì)對(duì)苯扎氯銨殺菌的影響 為了排除菌種特異性，本階段也隨機(jī)挑選本試驗(yàn)室現(xiàn)有保藏的兩種菌，一種為典型的革蘭氏陰性菌肺炎克雷伯氏菌，一種是典型的革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌。在這兩種菌中驗(yàn)證是否苯扎氯銨的殺菌也存在被陰離子抑制的現(xiàn)象。

分別取平臺(tái)期肺炎克雷伯氏菌及金黃色葡萄球菌50 μL的菌液離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液后，單處理組分別用100 μL ddH2O和0.9 % NaCl溶液重懸菌體，雙處理組分別用100 μL含苯扎氯銨的ddH2O和0.9 % NaCl溶液重懸菌體，處理肺炎克雷伯氏菌時(shí)苯扎氯銨終濃度分別設(shè)定為80、90、100 μg·mL-1，處理金黃色葡萄球菌時(shí)苯扎氯銨終濃度分別設(shè)定為100、120、150 μg·mL-1，處理時(shí)間設(shè)定為3 min。處理時(shí)間結(jié)束后立即離心(13 000 r·min-1、2 min)，去除上清液，然后用100 μL PBS緩沖液重懸菌體，洗滌2次后，再加入50 μL PBS緩沖液重懸菌體。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)通過(guò)ANOVA方差分析，數(shù)據(jù)來(lái)源于3次獨(dú)立試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯扎氯銨在ddH2O和0.9% NaCl介質(zhì)中殺滅平臺(tái)期鼠傷寒沙門氏菌效果的差異

由圖1可知，苯扎氯銨處理時(shí)間都為3 min時(shí)，40 μg·mL-1的濃度在ddH2O介質(zhì)和0.9% NaCl介質(zhì)中殺菌效果差異并不大，僅差異1個(gè)數(shù)量級(jí)。但隨著苯扎氯銨濃度的提高，處理時(shí)間不變的條件下，在兩種介質(zhì)中殺菌效果差異顯著。對(duì)比ddH2O介質(zhì)，在0.9% NaCl介質(zhì)中苯扎氯銨的殺菌效果明顯變差，在80 μg·mL-1的濃度時(shí)，二者差異達(dá)到5個(gè)數(shù)量級(jí)。說(shuō)明苯扎氯銨的殺菌受到了0.9% NaCl的抑制。因此，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在苯扎氯銨濃度相同及處理時(shí)間一致的條件下，僅改變苯扎氯銨的介質(zhì)，就導(dǎo)致殺菌效果存在極大差異。

圖1 苯扎氯銨在ddH2O和0.9% NaCl介質(zhì)中殺滅平臺(tái)期鼠傷寒沙門氏菌效果的差異Fig.1 Differences of the efficacy of benzalkonium chloride in killing Salmonella typhimurium at platform period in the medium of ddH2O and 0.9% NaCl

2.2 在6種不同介質(zhì)中驗(yàn)證苯扎氯銨殺滅平臺(tái)期鼠傷寒沙門氏菌效果的差異

由圖2可知，苯扎氯銨濃度都為60 μg·mL-1時(shí)，苯扎氯銨在6種不同介質(zhì)中殺菌效果都存在差異，主要可以分為2類。在DMSO、葡萄糖及正丁醇介質(zhì)中，苯扎氯銨殺菌效果明顯，與DMSO、葡萄糖及正丁醇單處理組相比差異極顯著(P<0.000 1)；而在KCl、CaCl2及MgCl2介質(zhì)中，苯扎氯銨殺菌效果很差，與KCl、CaCl2及MgCl2介質(zhì)單處理組相比差異不顯著(P>0.05)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在不會(huì)解離的介質(zhì)DMSO、葡萄糖及正丁醇中，苯扎氯銨的殺菌效果顯著，說(shuō)明其殺菌效果不會(huì)受到抑制；而在會(huì)解離的介質(zhì)KCl、CaCl2及MgCl2中，苯扎氯銨基本沒(méi)有殺菌效果，說(shuō)明其殺菌效果會(huì)受到明顯的抑制。

注：****表示P<0.000 1；NS表示P>0.05圖2 在6種不同介質(zhì)中驗(yàn)證苯扎氯銨殺滅平臺(tái)期鼠傷寒沙門氏菌效果的差異Fig.2 Differences of the efficacy of benzalkonium chloride in killing Salmonella typhimurium at platform period tested in six different media

2.3 添加8種不同氨基酸驗(yàn)證苯扎氯銨殺菌受到陰離子(負(fù)電)的抑制

由圖3可知，在水溶液中分別添加非極性氨基酸中的亮氨酸和甲硫氨酸、極性不帶電氨基酸中的半胱氨酸和甘氨酸及極性帶正電氨基酸中的精氨酸和賴氨酸，苯扎氯銨的殺菌效果明顯，與單處理組相比差異極顯著(P<0.000 1)。而在水溶液中分別添加極性帶負(fù)電氨基酸中的天冬氨酸和谷氨酸，苯扎氯銨的殺菌效果較其他類氨基酸明顯變差，與單處理組相比差異較顯著(P<0.01)。因此可以得出結(jié)論，苯扎氯銨的殺菌效果受到陰離子的抑制，也就是受到負(fù)電的影響。

注：****表示P<0.000 1；**表示P<0.01圖3 添加8種不同氨基酸驗(yàn)證苯扎氯銨殺菌受到陰離子(負(fù)電)的抑制Fig.3 Addition of eight different amino acids to verify the inhibition of bactericidal effect of benzalkonium chloride by anions (negative electricity)

2.4 在平臺(tái)期肺炎克雷伯氏菌及金黃色葡萄球菌中驗(yàn)證介質(zhì)對(duì)苯扎氯銨殺菌的影響

由圖4A和圖4B可知，在肺炎克雷伯氏菌和金黃色葡萄球菌中，苯扎氯銨對(duì)比在ddH2O介質(zhì)與0.9% NaCl介質(zhì)中，在ddH2O介質(zhì)中殺菌效果比在0.9% NaCl介質(zhì)中顯著。因此可以得出結(jié)論，在肺炎克雷伯氏菌和金黃色葡萄球菌中苯扎氯銨的殺菌也存在被陰離子抑制的現(xiàn)象，而非苯扎氯銨對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的特異性。

圖4 在平臺(tái)期肺炎克雷伯氏菌及金黃色葡萄球菌中驗(yàn)證介質(zhì)對(duì)苯扎氯銨殺菌的影響Fig.4 Effect of the medium on the sterilization of benzalkonium chloride tested in Klebsiella pneumoniae and Staphylococcus aureus at platform period

3 結(jié)論與討論

目前，畜禽細(xì)菌耐藥研究已受到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注，已有大量關(guān)于畜群細(xì)菌耐藥的研究報(bào)道，但未見(jiàn)我國(guó)從致病菌的角度，對(duì)來(lái)源于病死畜禽的多種潛在致病菌的研究報(bào)道[16-17]。研究者們大都聚焦于抗生素的增效減毒及新型抗生素的研發(fā)，但新抗生素的研發(fā)及批準(zhǔn)上市又陷入極為艱難的境地，所以尋找對(duì)沙門氏菌具有殺菌活性的其他藥物迫在眉睫，可以顯著降低新型抗生素研發(fā)的壓力。因此本研究想從鼠傷寒沙門氏菌和苯扎氯銨入手，對(duì)其耐藥性做一個(gè)深入的探究。

未來(lái)，對(duì)苯扎氯銨耐藥突變體的發(fā)病機(jī)制和流行病學(xué)研究將變得越來(lái)越重要[10]。本研究的發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步了解更好的消毒劑使用方法，那就是在不同的環(huán)境下可以特異性選擇不同的消毒劑來(lái)進(jìn)行消毒。在生產(chǎn)和使用苯扎氯銨時(shí)，就可通過(guò)此方法來(lái)優(yōu)化苯扎氯銨，例如苯扎氯銨溶劑的選擇以及在不具有或只有少數(shù)陰離子的環(huán)境下選擇苯扎氯銨消毒劑來(lái)進(jìn)行消毒。然而關(guān)于此現(xiàn)象，本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)并初步驗(yàn)證，還需要進(jìn)行后續(xù)研究，深入探究苯扎氯銨殺菌是如何受到陰離子的抑制，對(duì)其具體作用機(jī)制進(jìn)行解釋。日后以期本研究結(jié)果能夠?qū)⒈皆蠕@在農(nóng)牧業(yè)中應(yīng)用得更加規(guī)范，使其殺菌效果良好又不易產(chǎn)生耐藥性，以此協(xié)助農(nóng)牧業(yè)進(jìn)一步發(fā)展。