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      四川省套作玉米莖腐病致病鐮孢菌的分離與鑒定

      2018-11-09 07:22:10周歡歡王對平雍太文龔國淑楊文鈺常小麗
      關(guān)鍵詞:孢菌套作致病性

      周歡歡,嚴(yán) 靂,王對平,雍太文,2,龔國淑,尚 靜,2,楊文鈺,2,常小麗,2*

      (1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,成都 611130;2.四川省作物帶狀復(fù)合種植工程技術(shù)研究中心,成都 611130)

      玉米莖腐?。╩aize stalk rot)是世界玉米生產(chǎn)中普遍發(fā)生的一種真菌病害[1-2]。自20世紀(jì)70年代在我國首次報道后,相繼在黑龍江、吉林、河北、河南、陜西、廣西等20多個省區(qū)發(fā)病,該病可以引起玉米早衰、產(chǎn)量降低,田間一般發(fā)病率為10%~20%,嚴(yán)重地塊高達(dá)70%以上,甚至植株完全枯死[3]。據(jù)國內(nèi)外研究報道[4-6],鐮孢菌是引起玉米莖腐病的主要致病菌之一,其中輪枝鐮孢菌F.verticillioides、層生鐮孢菌F.proliferatum、禾谷鐮孢菌F.graminearum、膠孢鐮孢菌F.subglutinans、F.temperatum等,不僅可危害玉米產(chǎn)量和品質(zhì),而且其產(chǎn)生的毒素對人、畜健康造成危害[7-10]。受氣候條件、耕作栽培方式(保護(hù)性耕作、秸稈還田等)及玉米品種更替的影響,我國不同地區(qū)玉米莖腐病的優(yōu)勢致病菌存在差異[11]。

      近年來,楊文鈺等[12]在傳統(tǒng)間套作基礎(chǔ)上,系統(tǒng)研究了作物品種選配、田間優(yōu)化配置,形成了玉米-大豆帶狀復(fù)合種植的核心與配套技術(shù),大大提高土地生產(chǎn)率與光肥利用率,改善農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng),降低病蟲草害損失率,與凈作玉米相比,在玉米不減產(chǎn)的情況下多收一季大豆,實現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)、生態(tài)與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展相統(tǒng)一[13-14],目前在我國西南、西北、黃淮海等地區(qū)推廣面積逐年增加。但關(guān)于玉米-大豆帶狀套作下玉米莖腐病的發(fā)生情況及病原菌種類尚不清楚。本研究對四川省玉米大豆帶狀套作4個主要栽培縣(市)的玉米莖腐病進(jìn)行調(diào)查及取樣,采用形態(tài)特征和分子鑒定對病原菌進(jìn)行鑒定和致病性檢測,以便掌握該模式下玉米莖腐病的發(fā)生情況及病原菌類群,為玉米大豆帶狀套作下玉米莖腐病的防治提供參考。

      1 材料和方法

      1.1 供試材料

      1.1.1 供試菌株

      2016—2017年間分別對四川省雅安市、成都市崇州區(qū)、自貢市榮縣和眉山市仁壽縣4個市(縣)的玉米-大豆帶狀套作栽培田中玉米莖腐病病樣進(jìn)行采集。選取病狀典型,且莖部未完全腐爛的病樣本112份,進(jìn)行室內(nèi)組織分離、純化及鑒定。

      1.1.2 供試植物

      室內(nèi)病原菌致病性檢測采用玉米品種登海605。

      1.1.3 培養(yǎng)基

      馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)∶200 g馬鈴薯,20 g瓊脂,20 g葡萄糖,用水定容至1 L。羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(CMS)∶羧甲基纖維素鈉7.5 g,酵母膏0.5 g,磷酸氫二鉀0.5 g和硫酸鎂0.25 g,用水定容至1 L。清水瓊脂培養(yǎng)基(WA)∶10 g瓊脂,10 g葡萄糖,用水定容至1 L。以上培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌30 min,冷卻待用。

      1.2 試驗方法

      1.2.1 田間病害調(diào)查

      2016—2017年間分別對四川省雅安市、成都市崇州區(qū)、自貢市榮縣和眉山市仁壽縣4個市(縣)的玉米-大豆帶狀套作栽培田進(jìn)行調(diào)查及取樣。其中,玉米-大豆帶狀套作栽培具體試驗設(shè)計為:玉米于3月底4月初采用寬窄行種植,窄行40 cm,寬行160 cm,株距10 cm;大豆于6月上旬播種于玉米寬行,種植2行,行距40 cm,株距20 cm。玉米底肥穴施尿素330 kg/hm2、過磷酸鈣750 kg/hm2和氯化鉀 150 kg/hm2,在大喇叭口期追施尿素330 kg/hm2;大豆底肥施尿素65 kg/hm2、過磷酸鈣 420 kg/hm2、氯化鉀 70 kg/hm2。其他按照常規(guī)進(jìn)行管理。其中,玉米品種為登海605,大豆品種為南豆12。

      于玉米乳熟期分別在4個市(縣)選擇3~5個主栽區(qū),采用隨機(jī)抽樣調(diào)查玉米莖腐病的發(fā)病情況,參照李春霞等[15]病情級別標(biāo)準(zhǔn),計算發(fā)病率及病情指數(shù),公式如下:

      1.2.2 病原菌分離與純化

      剪取玉米莖腐病病樣的莖部組織約0.5 cm×0.5 cm,依次用75%乙醇消毒30 s,5%NaClO消毒45 s,無菌水沖洗3次,在滅菌濾紙充分晾干后,移至9 cm的PDA平板上,每皿4個,置于25℃下培養(yǎng)3~5 d后觀察。挑取鐮孢菌菌落外緣菌絲或者單個孢子法,獲得鐮孢菌純化菌株。

      1.2.3 病原菌鑒定

      形態(tài)學(xué)鑒定:采用J.F.Leslie和B.A.Summerell的鐮孢菌鑒定方法[16],根據(jù)菌落形態(tài)、質(zhì)地、菌絲是否有隔膜、分生孢子形態(tài)、大小對分離菌株進(jìn)行鑒定。

      分子鑒定:將獲得的單孢菌株轉(zhuǎn)移至PDA平板上,25℃培養(yǎng)7 d。參照何宛芹等[17]的CTAB法提取病原菌 DNA。采用 ITS1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和 ITS4(5’-gctgcgttcttcatcgatgc-3’)[18]對各鐮孢菌rDNA-ITS基因的區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系:DNA 模板 1 μL、上下游引物各 1 μL、2×PCR Master Mix12.5 μL、ddH2O 補(bǔ)至 25 μL。PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性 5 min;94℃變性 45 s;58℃退火 45 s;72℃延伸2 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。采用 EF1-728F(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和 EF1-986R(5’-gctgcgttcttcatcgatgc-3’)[19]對延長因子基因序列PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系:DNA模板1 μL、上下游引物各 1 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 補(bǔ)至 25 μL。PCR 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性 3 min,95℃變性 20 s,55 ℃復(fù)性 30 s,72 ℃延伸 40 s,35 個循環(huán),72℃延伸10 min,4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往上海生物工程有限公司測序。測序結(jié)果與NCBI基因庫中已登錄的鐮孢菌序列進(jìn)行Blast n比對,并將待測菌株序列和NCBI基因庫中與之相似度較高的序列一起導(dǎo)入Clustal X軟件序列比對。利用MEGA 6.0軟件采用MP(Maximum-Parsimony)最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自檢次數(shù)為1 000次。

      1.2.4 致病性測定

      選取7個鐮孢菌種的代表菌株各3株接種于PDA培養(yǎng)基上活化,置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d,待菌落長至培養(yǎng)皿邊緣時,打菌餅(直徑為5 mm)用于接種。玉米種子經(jīng)75%乙醇消毒3 min,無菌水重新干凈后,置于珍珠巖中,25℃在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待玉米幼苗長至15 cm高時,參照戴浩[20]接種方法及評級標(biāo)準(zhǔn),具體操作為:在玉米幼苗基部輕刺3個傷口,貼上菌餅,用保鮮膜纏繞,置于25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行保濕培養(yǎng),3 d后觀察發(fā)病情況,每個代表菌株接種20株玉米幼苗。病情級別分4級,分別為:0級,健康,整株生長正常,未發(fā)??;1級,輕度發(fā)病,莖基部接種部位有輕微變色但未見明顯病斑;3級,中度發(fā)病,莖基部變色明顯,病斑明顯拓展;5級,重度發(fā)病,病斑明顯,莖基部幾乎變褐,病斑環(huán)繞整個植株,有些莖基部完全腐爛,植株死亡。

      1.3 數(shù)據(jù)處理分析

      田間病害調(diào)查、菌株分離結(jié)果及致病性檢測所得數(shù)據(jù),均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。檢驗方法為鄧肯氏多重比較法,分析后各樣本平均數(shù)間是否有顯著差異。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 田間調(diào)查結(jié)果

      2016—2017年間,通過對四川省4個縣市玉米大豆套作栽培下玉米莖腐病情況調(diào)查。結(jié)果顯示玉米莖腐病在各地均有發(fā)生,但發(fā)病率和病情指數(shù)在不同地區(qū)存在差異。自貢市榮縣的玉米莖腐病田間發(fā)病率均高于其他3個地區(qū),發(fā)病率為11.52%,病情指數(shù)為13.49;雅安和崇州的玉米莖腐病田間表現(xiàn)發(fā)病率均較低,病情指數(shù)差異不顯著;仁壽地區(qū)莖腐病相對其他地區(qū)發(fā)病率和病情指數(shù)最低(見表1)??傮w來看,四川玉米大豆套作栽培下,玉米莖腐病發(fā)生較輕,平均發(fā)病率為8.45%,平均病情指數(shù)為11.16。

      表1 四川省玉米大豆套作下玉米莖腐病發(fā)病情況Table 1 Occurrence status of maize stalk rot

      2.2 病原菌分離及鑒定結(jié)果

      2.2.1 玉米莖腐病鐮孢菌鑒定結(jié)果

      從供試103株玉米莖腐病分離菌株中獲得71株鐮孢菌,根據(jù)菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)(見圖1),對菌株的基因區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列分析,選取部分鐮孢菌序列與下載參照菌株序列構(gòu)建ITS-EF多基因系統(tǒng)發(fā)育樹,并以Bipolaris oryzae作外群,采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖2所示,供試菌株可分為2個大分支7個組,第1組Y9、Y12、Z1和C10與2個禾谷鐮孢菌F.graminearum參考菌株聚在一起,相似性高達(dá)100%;第2組中Y1、C9、Z8和Z10與木賊鐮孢菌F.equiseti參考菌株聚在同一分支;第3組中,Y16、C5和S8與輪枝鐮孢菌F.verticillioides參考菌株相似性為54%;第4組中,C1、S3、Y5和S17與尖孢鐮孢菌F.oxysporum參考菌株以相似性70%聚在一起;第5組中,Y11、C2和S5等7個菌株與3個腐皮鐮孢菌F.solani參考菌株的序列相似性高達(dá)76%;第6組中,Y17、S1和Z53個菌株與藤倉鐮孢菌F.fujikuroi參考菌株相似度為57%;最后一分支中,Y4、Y8和S2等16個菌株與層生鐮孢菌F.proliferatum聚在一起,相似性達(dá)87%。結(jié)合形態(tài)特征和分子鑒定,可將分離獲得的鐮孢菌分為7種,包括層生鐮孢菌、腐皮鐮孢菌、輪枝鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、尖孢鐮孢菌、藤倉鐮孢菌和木賊鐮孢菌。

      圖1 玉米莖腐病鐮孢菌菌落和分生孢子形態(tài)特征圖Figure 1 Morphologies of colonies and microconidia of Fusarium isolates associated with maize stalk rot

      2.2.2 套作玉米莖腐病各鐮孢菌分離頻率

      在分離自玉米莖腐病的103株菌株中,共鑒定出7種鐮孢菌(見表2)。其中,層生鐮孢菌分離頻率最高,為35.21%;腐皮和輪枝鐮孢菌次之,分離頻率分別為16.9%和15.49%,禾谷鐮孢菌較低,而尖孢鐮孢菌、藤倉鐮孢菌和木賊鐮孢菌最低,均不足10%。就不同地區(qū)而言,層生鐮孢菌的分離頻率均最高,為各地區(qū)優(yōu)勢鐮孢菌;仁壽地區(qū)無禾谷鐮孢菌和木賊鐮孢菌,其他種類鐮孢菌均有分布;崇州地區(qū)無藤倉鐮孢菌分布;榮縣地區(qū)禾谷鐮孢菌的分離頻率在4個區(qū)域中最高,無尖孢鐮孢菌分布。綜合來看,四川玉米大豆套作栽培下,玉米莖腐病鐮孢菌的優(yōu)勢類群為層生鐮孢菌、輪枝鐮孢菌、腐皮鐮孢菌和禾谷鐮孢菌。

      2.3 致病性測定

      選取玉米莖腐病7種鐮孢菌代表菌株各3株,采用玉米幼苗刺傷接種法進(jìn)行致病性檢測,結(jié)果如圖4所示,在刺傷接種第3天后,不同病菌的致病力差異較大:禾谷鐮孢菌致病性最強(qiáng),病斑變褐、凹陷、病斑擴(kuò)展明顯。發(fā)病率高達(dá)95%且病情指數(shù)大于3;層生鐮孢菌和輪枝鐮孢菌接種后玉米莖稈部位出現(xiàn)水漬狀病斑、變褐色,并伴有腐爛癥狀且有大量菌絲產(chǎn)生,發(fā)病率分別為91.67%和78.33%,病情指數(shù)均在2~3之間;木賊鐮孢菌和尖孢鐮孢菌發(fā)病率分別為81.67%和66.67%,病情指數(shù)為1.58和1.2,兩種鐮孢菌可引起玉米莖部出現(xiàn)部分水漬狀變色、病斑擴(kuò)增不明顯,有少許菌絲出現(xiàn)。藤倉鐮孢菌和腐皮鐮孢菌也可引起莖稈部位變色但病狀不明顯,發(fā)病率分別為65%和71.67%,病情指數(shù)最低。因此分離獲得各鐮孢菌中,以禾谷鐮孢菌致病性最強(qiáng),層生鐮孢菌和輪枝鐮孢菌次之,尖孢鐮孢菌和木賊鐮孢菌致病性較弱,藤倉鐮孢菌和腐皮鐮孢菌致病性最弱。

      表2 四川省玉豆套作下玉米莖腐病鐮孢菌的分離頻率Table 2 Isolation frequency of Fusarium species associated with corn stalk rot

      圖2 玉米莖腐病rDNA ITS和EF1-α序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree based on rDNA ITS and EF1-α fragments of Fusarium strains causing maize stalk rot

      圖3 鐮孢菌接種引起的玉米發(fā)病癥狀Figure 3 Symptoms on maize seedlings inoculated with representative Fusarium isolates

      3 討論與結(jié)論

      我國玉米莖腐病分布范圍廣,危害嚴(yán)重,輪枝鐮孢菌和禾谷鐮孢菌是我國玉米莖腐病的優(yōu)勢致病鐮孢菌,但各地受不同因素影響,鐮孢菌的種類及優(yōu)勢致病菌存在差異。本研究表明,四川玉米大豆套作栽培下玉米莖腐病鐮孢菌的優(yōu)勢種為層生鐮孢菌、輪枝鐮孢菌和禾谷鐮孢菌,但不同地區(qū)鐮孢菌的種群結(jié)構(gòu)及分布存在差異。

      表3 鐮孢菌代表菌株接種引起的玉米發(fā)病Table 3 Disease incidence and grade on maize seedlings inoculated with representative Fusarium isolates

      晉齊鳴等[21]研究發(fā)現(xiàn)保護(hù)性免耕、少耕或秸稈還田等耕作方式,實行玉米寬窄行交替休閑耕作,可加重玉米莖腐病的發(fā)生。魏薦酈[22]于2013—2014年對四川省玉米莖腐病進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn),平均發(fā)病率為17.18%;通過研究不同栽培模式對玉米莖腐病的影響發(fā)現(xiàn),小麥-玉米套作田中玉米莖腐病的病情指數(shù)高于凈作田,分別為17.38和13.32,秸稈還田處理后可加重兩種栽培方式下玉米莖腐病的發(fā)生。本試驗表明,四川玉米大豆帶狀套作栽培下玉米莖腐病平均發(fā)病率為8.45%,明顯低于魏薦酈[22]在凈作玉米和小麥-玉米套作田中的調(diào)查結(jié)果,表明玉米大豆帶狀套作不僅增產(chǎn)效果好,而且可有效地降低玉米莖腐病的發(fā)生。但總體來說,近年來四川玉米莖腐病發(fā)生情況不嚴(yán)重,可能與該地區(qū)多樣化的玉米栽培方式有關(guān)。

      在我國,玉米莖腐病的優(yōu)勢致病菌為禾谷鐮孢菌復(fù)合群和輪枝鐮孢菌[1,4,11]。Yu C.等[1]對我國東北地區(qū)玉米莖腐病的病原菌進(jìn)行調(diào)查及鑒定發(fā)現(xiàn),共分離獲得9種鐮孢菌,其中輪枝鐮孢菌和禾谷鐮孢菌為強(qiáng)致病菌株。袁紅霞等[23]對河南省玉米莖腐病病原菌鑒定發(fā)現(xiàn),禾谷鐮孢菌分離頻率和致病性最強(qiáng),輪枝鐮孢菌致病性較弱。何婧[24]通過對東北春玉米區(qū)、黃淮海夏玉米區(qū)以及云南、陜西等省部分地區(qū)的玉米莖腐病病原菌進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn),輪枝鐮孢菌為優(yōu)勢致病菌,其次為禾谷鐮孢復(fù)合種。在四川省,魏薦酈[22]通過對凈作和麥玉套作栽培下玉米莖腐病病原菌的鑒定結(jié)果表明,層生鐮孢菌和木賊鐮孢菌分離頻率最高,為優(yōu)勢致病菌,輪枝鐮孢菌是次優(yōu)勢致病菌,而禾谷鐮孢菌和九州鐮孢菌Fusarium kyushuense分離頻率較低。與魏薦酈[22]分離的病原菌種類不完全相同,本試驗從玉米大豆帶狀套作下共分離獲得7種玉米莖腐病鐮孢菌,除了層生鐮孢菌、輪枝鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、木賊鐮孢菌,還分離獲得了尖孢鐮孢菌、腐皮鐮孢菌和藤倉鐮孢菌,但未分離到九州鐮孢菌,這表明不同玉米栽培方式可能影響玉米莖腐病的鐮孢菌類群。

      此外,本研究中已分離鑒定的7種鐮孢菌中,禾谷鐮孢菌的致病性更強(qiáng)。眾所周知,禾谷鐮孢菌可危害小麥、玉米、大麥等作物,導(dǎo)致穗腐病和莖腐病,也可引起大豆莖基腐和根腐病。在四川、重慶等西南地區(qū),除凈作,玉米常與小麥輪作或者與大豆套作,研究發(fā)現(xiàn)來源于小麥、玉米和大麥病樣的禾谷鐮孢菌對玉米的致病性差異并不顯著[26-27],小麥玉米輪作有利于田間病殘體及土壤中禾谷鐮孢菌的積累,從而加重穗腐病和莖腐病的發(fā)生[11,25]。輪枝鐮孢菌作為玉米莖腐病的重要致病菌,可在田間病殘體、土壤表面或土壤內(nèi)存活,但對大豆的影響并不大。D.Kendra[28]通過RT-PCR對玉米大豆輪作田中健康大豆植株進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),大豆體內(nèi)雖可檢測到輪枝鐮孢菌,卻未影響大豆生長,這就解釋了玉米-大豆帶狀套作下輪枝鐮孢菌的分離頻率較高,但對玉米的致病性不及禾谷鐮孢菌。

      綜上所述,四川省玉米大豆套作系統(tǒng)下,鐮孢菌所引起的玉米莖腐病田間發(fā)病率不高,鐮孢菌群體與國內(nèi)其他省份存在差異,但禾谷鐮孢菌仍為強(qiáng)致病菌,對于該地區(qū)玉米莖腐病的發(fā)生具有潛在威脅。同時,玉米大豆帶狀套作栽培可降低玉米莖腐病的發(fā)生,減少化學(xué)農(nóng)藥使用量,具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益,為本地區(qū)玉米生產(chǎn)提供了有價值的參考。

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