四川省套作玉米莖腐病致病鐮孢菌的分離與鑒定

周歡歡，嚴(yán) 靂，王對平，雍太文，2，龔國淑，尚 靜，2，楊文鈺，2，常小麗，2*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130；2.四川省作物帶狀復(fù)合種植工程技術(shù)研究中心，成都 611130）

玉米莖腐?。╩aize stalk rot）是世界玉米生產(chǎn)中普遍發(fā)生的一種真菌病害[1-2]。自20世紀(jì)70年代在我國首次報道后，相繼在黑龍江、吉林、河北、河南、陜西、廣西等20多個省區(qū)發(fā)病，該病可以引起玉米早衰、產(chǎn)量降低，田間一般發(fā)病率為10%～20%，嚴(yán)重地塊高達(dá)70%以上，甚至植株完全枯死[3]。據(jù)國內(nèi)外研究報道[4-6]，鐮孢菌是引起玉米莖腐病的主要致病菌之一，其中輪枝鐮孢菌F.verticillioides、層生鐮孢菌F.proliferatum、禾谷鐮孢菌F.graminearum、膠孢鐮孢菌F.subglutinans、F.temperatum等，不僅可危害玉米產(chǎn)量和品質(zhì)，而且其產(chǎn)生的毒素對人、畜健康造成危害[7-10]。受氣候條件、耕作栽培方式（保護(hù)性耕作、秸稈還田等）及玉米品種更替的影響，我國不同地區(qū)玉米莖腐病的優(yōu)勢致病菌存在差異[11]。

近年來，楊文鈺等[12]在傳統(tǒng)間套作基礎(chǔ)上，系統(tǒng)研究了作物品種選配、田間優(yōu)化配置，形成了玉米-大豆帶狀復(fù)合種植的核心與配套技術(shù)，大大提高土地生產(chǎn)率與光肥利用率，改善農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，降低病蟲草害損失率，與凈作玉米相比，在玉米不減產(chǎn)的情況下多收一季大豆，實現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)、生態(tài)與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展相統(tǒng)一[13-14]，目前在我國西南、西北、黃淮海等地區(qū)推廣面積逐年增加。但關(guān)于玉米-大豆帶狀套作下玉米莖腐病的發(fā)生情況及病原菌種類尚不清楚。本研究對四川省玉米大豆帶狀套作4個主要栽培縣（市）的玉米莖腐病進(jìn)行調(diào)查及取樣，采用形態(tài)特征和分子鑒定對病原菌進(jìn)行鑒定和致病性檢測，以便掌握該模式下玉米莖腐病的發(fā)生情況及病原菌類群，為玉米大豆帶狀套作下玉米莖腐病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

2016—2017年間分別對四川省雅安市、成都市崇州區(qū)、自貢市榮縣和眉山市仁壽縣4個市（縣）的玉米-大豆帶狀套作栽培田中玉米莖腐病病樣進(jìn)行采集。選取病狀典型，且莖部未完全腐爛的病樣本112份，進(jìn)行室內(nèi)組織分離、純化及鑒定。

1.1.2 供試植物

室內(nèi)病原菌致病性檢測采用玉米品種登海605。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）∶200 g馬鈴薯，20 g瓊脂，20 g葡萄糖，用水定容至1 L。羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMS）∶羧甲基纖維素鈉7.5 g，酵母膏0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g和硫酸鎂0.25 g，用水定容至1 L。清水瓊脂培養(yǎng)基（WA）∶10 g瓊脂，10 g葡萄糖，用水定容至1 L。以上培養(yǎng)基在121℃高壓滅菌30 min，冷卻待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間病害調(diào)查

2016—2017年間分別對四川省雅安市、成都市崇州區(qū)、自貢市榮縣和眉山市仁壽縣4個市（縣）的玉米-大豆帶狀套作栽培田進(jìn)行調(diào)查及取樣。其中，玉米-大豆帶狀套作栽培具體試驗設(shè)計為：玉米于3月底4月初采用寬窄行種植，窄行40 cm，寬行160 cm，株距10 cm；大豆于6月上旬播種于玉米寬行，種植2行，行距40 cm，株距20 cm。玉米底肥穴施尿素330 kg/hm2、過磷酸鈣750 kg/hm2和氯化鉀 150 kg/hm2，在大喇叭口期追施尿素330 kg/hm2；大豆底肥施尿素65 kg/hm2、過磷酸鈣 420 kg/hm2、氯化鉀 70 kg/hm2。其他按照常規(guī)進(jìn)行管理。其中，玉米品種為登海605，大豆品種為南豆12。

于玉米乳熟期分別在4個市（縣）選擇3～5個主栽區(qū)，采用隨機(jī)抽樣調(diào)查玉米莖腐病的發(fā)病情況，參照李春霞等[15]病情級別標(biāo)準(zhǔn)，計算發(fā)病率及病情指數(shù)，公式如下：

1.2.2 病原菌分離與純化

剪取玉米莖腐病病樣的莖部組織約0.5 cm×0.5 cm，依次用75%乙醇消毒30 s，5%NaClO消毒45 s，無菌水沖洗3次，在滅菌濾紙充分晾干后，移至9 cm的PDA平板上，每皿4個，置于25℃下培養(yǎng)3～5 d后觀察。挑取鐮孢菌菌落外緣菌絲或者單個孢子法，獲得鐮孢菌純化菌株。

1.2.3 病原菌鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：采用J.F.Leslie和B.A.Summerell的鐮孢菌鑒定方法[16]，根據(jù)菌落形態(tài)、質(zhì)地、菌絲是否有隔膜、分生孢子形態(tài)、大小對分離菌株進(jìn)行鑒定。

分子鑒定：將獲得的單孢菌株轉(zhuǎn)移至PDA平板上，25℃培養(yǎng)7 d。參照何宛芹等[17]的CTAB法提取病原菌 DNA。采用 ITS1（5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’）和 ITS4（5’-gctgcgttcttcatcgatgc-3’）[18]對各鐮孢菌rDNA-ITS基因的區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：DNA 模板 1 μL、上下游引物各 1 μL、2×PCR Master Mix12.5 μL、ddH2O 補(bǔ)至 25 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 45 s；58℃退火 45 s；72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。采用 EF1-728F（5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’）和 EF1-986R（5’-gctgcgttcttcatcgatgc-3’）[19]對延長因子基因序列PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：DNA模板1 μL、上下游引物各 1 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 補(bǔ)至 25 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 3 min，95℃變性 20 s，55 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸 40 s，35 個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往上海生物工程有限公司測序。測序結(jié)果與NCBI基因庫中已登錄的鐮孢菌序列進(jìn)行Blast n比對，并將待測菌株序列和NCBI基因庫中與之相似度較高的序列一起導(dǎo)入Clustal X軟件序列比對。利用MEGA 6.0軟件采用MP（Maximum-Parsimony）最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自檢次數(shù)為1 000次。

1.2.4 致病性測定

選取7個鐮孢菌種的代表菌株各3株接種于PDA培養(yǎng)基上活化，置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，待菌落長至培養(yǎng)皿邊緣時，打菌餅（直徑為5 mm）用于接種。玉米種子經(jīng)75%乙醇消毒3 min，無菌水重新干凈后，置于珍珠巖中，25℃在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待玉米幼苗長至15 cm高時，參照戴浩[20]接種方法及評級標(biāo)準(zhǔn)，具體操作為：在玉米幼苗基部輕刺3個傷口，貼上菌餅，用保鮮膜纏繞，置于25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行保濕培養(yǎng)，3 d后觀察發(fā)病情況，每個代表菌株接種20株玉米幼苗。病情級別分4級，分別為：0級，健康，整株生長正常，未發(fā)??；1級，輕度發(fā)病，莖基部接種部位有輕微變色但未見明顯病斑；3級，中度發(fā)病，莖基部變色明顯，病斑明顯拓展；5級，重度發(fā)病，病斑明顯，莖基部幾乎變褐，病斑環(huán)繞整個植株，有些莖基部完全腐爛，植株死亡。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

田間病害調(diào)查、菌株分離結(jié)果及致病性檢測所得數(shù)據(jù)，均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。檢驗方法為鄧肯氏多重比較法，分析后各樣本平均數(shù)間是否有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間調(diào)查結(jié)果

2016—2017年間，通過對四川省4個縣市玉米大豆套作栽培下玉米莖腐病情況調(diào)查。結(jié)果顯示玉米莖腐病在各地均有發(fā)生，但發(fā)病率和病情指數(shù)在不同地區(qū)存在差異。自貢市榮縣的玉米莖腐病田間發(fā)病率均高于其他3個地區(qū)，發(fā)病率為11.52%，病情指數(shù)為13.49；雅安和崇州的玉米莖腐病田間表現(xiàn)發(fā)病率均較低，病情指數(shù)差異不顯著；仁壽地區(qū)莖腐病相對其他地區(qū)發(fā)病率和病情指數(shù)最低（見表1）?？傮w來看，四川玉米大豆套作栽培下，玉米莖腐病發(fā)生較輕，平均發(fā)病率為8.45%，平均病情指數(shù)為11.16。

表1 四川省玉米大豆套作下玉米莖腐病發(fā)病情況Table 1 Occurrence status of maize stalk rot

2.2 病原菌分離及鑒定結(jié)果

2.2.1 玉米莖腐病鐮孢菌鑒定結(jié)果

從供試103株玉米莖腐病分離菌株中獲得71株鐮孢菌，根據(jù)菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)（見圖1），對菌株的基因區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列分析，選取部分鐮孢菌序列與下載參照菌株序列構(gòu)建ITS-EF多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，并以Bipolaris oryzae作外群，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，供試菌株可分為2個大分支7個組，第1組Y9、Y12、Z1和C10與2個禾谷鐮孢菌F.graminearum參考菌株聚在一起，相似性高達(dá)100%；第2組中Y1、C9、Z8和Z10與木賊鐮孢菌F.equiseti參考菌株聚在同一分支；第3組中，Y16、C5和S8與輪枝鐮孢菌F.verticillioides參考菌株相似性為54%；第4組中，C1、S3、Y5和S17與尖孢鐮孢菌F.oxysporum參考菌株以相似性70%聚在一起；第5組中，Y11、C2和S5等7個菌株與3個腐皮鐮孢菌F.solani參考菌株的序列相似性高達(dá)76%；第6組中，Y17、S1和Z53個菌株與藤倉鐮孢菌F.fujikuroi參考菌株相似度為57%；最后一分支中，Y4、Y8和S2等16個菌株與層生鐮孢菌F.proliferatum聚在一起，相似性達(dá)87%。結(jié)合形態(tài)特征和分子鑒定，可將分離獲得的鐮孢菌分為7種，包括層生鐮孢菌、腐皮鐮孢菌、輪枝鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、尖孢鐮孢菌、藤倉鐮孢菌和木賊鐮孢菌。

圖1 玉米莖腐病鐮孢菌菌落和分生孢子形態(tài)特征圖Figure 1 Morphologies of colonies and microconidia of Fusarium isolates associated with maize stalk rot

2.2.2 套作玉米莖腐病各鐮孢菌分離頻率

在分離自玉米莖腐病的103株菌株中，共鑒定出7種鐮孢菌（見表2）。其中，層生鐮孢菌分離頻率最高，為35.21%；腐皮和輪枝鐮孢菌次之，分離頻率分別為16.9%和15.49%，禾谷鐮孢菌較低，而尖孢鐮孢菌、藤倉鐮孢菌和木賊鐮孢菌最低，均不足10%。就不同地區(qū)而言，層生鐮孢菌的分離頻率均最高，為各地區(qū)優(yōu)勢鐮孢菌；仁壽地區(qū)無禾谷鐮孢菌和木賊鐮孢菌，其他種類鐮孢菌均有分布；崇州地區(qū)無藤倉鐮孢菌分布；榮縣地區(qū)禾谷鐮孢菌的分離頻率在4個區(qū)域中最高，無尖孢鐮孢菌分布。綜合來看，四川玉米大豆套作栽培下，玉米莖腐病鐮孢菌的優(yōu)勢類群為層生鐮孢菌、輪枝鐮孢菌、腐皮鐮孢菌和禾谷鐮孢菌。

2.3 致病性測定

選取玉米莖腐病7種鐮孢菌代表菌株各3株，采用玉米幼苗刺傷接種法進(jìn)行致病性檢測，結(jié)果如圖4所示，在刺傷接種第3天后，不同病菌的致病力差異較大：禾谷鐮孢菌致病性最強(qiáng)，病斑變褐、凹陷、病斑擴(kuò)展明顯。發(fā)病率高達(dá)95%且病情指數(shù)大于3；層生鐮孢菌和輪枝鐮孢菌接種后玉米莖稈部位出現(xiàn)水漬狀病斑、變褐色，并伴有腐爛癥狀且有大量菌絲產(chǎn)生，發(fā)病率分別為91.67%和78.33%，病情指數(shù)均在2～3之間；木賊鐮孢菌和尖孢鐮孢菌發(fā)病率分別為81.67%和66.67%，病情指數(shù)為1.58和1.2，兩種鐮孢菌可引起玉米莖部出現(xiàn)部分水漬狀變色、病斑擴(kuò)增不明顯，有少許菌絲出現(xiàn)。藤倉鐮孢菌和腐皮鐮孢菌也可引起莖稈部位變色但病狀不明顯，發(fā)病率分別為65%和71.67%，病情指數(shù)最低。因此分離獲得各鐮孢菌中，以禾谷鐮孢菌致病性最強(qiáng)，層生鐮孢菌和輪枝鐮孢菌次之，尖孢鐮孢菌和木賊鐮孢菌致病性較弱，藤倉鐮孢菌和腐皮鐮孢菌致病性最弱。

表2 四川省玉豆套作下玉米莖腐病鐮孢菌的分離頻率Table 2 Isolation frequency of Fusarium species associated with corn stalk rot

圖2 玉米莖腐病rDNA ITS和EF1-α序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree based on rDNA ITS and EF1-α fragments of Fusarium strains causing maize stalk rot

圖3 鐮孢菌接種引起的玉米發(fā)病癥狀Figure 3 Symptoms on maize seedlings inoculated with representative Fusarium isolates

3 討論與結(jié)論

我國玉米莖腐病分布范圍廣，危害嚴(yán)重，輪枝鐮孢菌和禾谷鐮孢菌是我國玉米莖腐病的優(yōu)勢致病鐮孢菌，但各地受不同因素影響，鐮孢菌的種類及優(yōu)勢致病菌存在差異。本研究表明，四川玉米大豆套作栽培下玉米莖腐病鐮孢菌的優(yōu)勢種為層生鐮孢菌、輪枝鐮孢菌和禾谷鐮孢菌，但不同地區(qū)鐮孢菌的種群結(jié)構(gòu)及分布存在差異。

表3 鐮孢菌代表菌株接種引起的玉米發(fā)病Table 3 Disease incidence and grade on maize seedlings inoculated with representative Fusarium isolates

晉齊鳴等[21]研究發(fā)現(xiàn)保護(hù)性免耕、少耕或秸稈還田等耕作方式，實行玉米寬窄行交替休閑耕作，可加重玉米莖腐病的發(fā)生。魏薦酈[22]于2013—2014年對四川省玉米莖腐病進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，平均發(fā)病率為17.18%；通過研究不同栽培模式對玉米莖腐病的影響發(fā)現(xiàn)，小麥-玉米套作田中玉米莖腐病的病情指數(shù)高于凈作田，分別為17.38和13.32，秸稈還田處理后可加重兩種栽培方式下玉米莖腐病的發(fā)生。本試驗表明，四川玉米大豆帶狀套作栽培下玉米莖腐病平均發(fā)病率為8.45%，明顯低于魏薦酈[22]在凈作玉米和小麥-玉米套作田中的調(diào)查結(jié)果，表明玉米大豆帶狀套作不僅增產(chǎn)效果好，而且可有效地降低玉米莖腐病的發(fā)生。但總體來說，近年來四川玉米莖腐病發(fā)生情況不嚴(yán)重，可能與該地區(qū)多樣化的玉米栽培方式有關(guān)。

在我國，玉米莖腐病的優(yōu)勢致病菌為禾谷鐮孢菌復(fù)合群和輪枝鐮孢菌[1，4，11]。Yu C.等[1]對我國東北地區(qū)玉米莖腐病的病原菌進(jìn)行調(diào)查及鑒定發(fā)現(xiàn)，共分離獲得9種鐮孢菌，其中輪枝鐮孢菌和禾谷鐮孢菌為強(qiáng)致病菌株。袁紅霞等[23]對河南省玉米莖腐病病原菌鑒定發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮孢菌分離頻率和致病性最強(qiáng)，輪枝鐮孢菌致病性較弱。何婧[24]通過對東北春玉米區(qū)、黃淮海夏玉米區(qū)以及云南、陜西等省部分地區(qū)的玉米莖腐病病原菌進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，輪枝鐮孢菌為優(yōu)勢致病菌，其次為禾谷鐮孢復(fù)合種。在四川省，魏薦酈[22]通過對凈作和麥玉套作栽培下玉米莖腐病病原菌的鑒定結(jié)果表明，層生鐮孢菌和木賊鐮孢菌分離頻率最高，為優(yōu)勢致病菌，輪枝鐮孢菌是次優(yōu)勢致病菌，而禾谷鐮孢菌和九州鐮孢菌Fusarium kyushuense分離頻率較低。與魏薦酈[22]分離的病原菌種類不完全相同，本試驗從玉米大豆帶狀套作下共分離獲得7種玉米莖腐病鐮孢菌，除了層生鐮孢菌、輪枝鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、木賊鐮孢菌，還分離獲得了尖孢鐮孢菌、腐皮鐮孢菌和藤倉鐮孢菌，但未分離到九州鐮孢菌，這表明不同玉米栽培方式可能影響玉米莖腐病的鐮孢菌類群。

此外，本研究中已分離鑒定的7種鐮孢菌中，禾谷鐮孢菌的致病性更強(qiáng)。眾所周知，禾谷鐮孢菌可危害小麥、玉米、大麥等作物，導(dǎo)致穗腐病和莖腐病，也可引起大豆莖基腐和根腐病。在四川、重慶等西南地區(qū)，除凈作，玉米常與小麥輪作或者與大豆套作，研究發(fā)現(xiàn)來源于小麥、玉米和大麥病樣的禾谷鐮孢菌對玉米的致病性差異并不顯著[26-27]，小麥玉米輪作有利于田間病殘體及土壤中禾谷鐮孢菌的積累，從而加重穗腐病和莖腐病的發(fā)生[11，25]。輪枝鐮孢菌作為玉米莖腐病的重要致病菌，可在田間病殘體、土壤表面或土壤內(nèi)存活，但對大豆的影響并不大。D.Kendra[28]通過RT-PCR對玉米大豆輪作田中健康大豆植株進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，大豆體內(nèi)雖可檢測到輪枝鐮孢菌，卻未影響大豆生長，這就解釋了玉米-大豆帶狀套作下輪枝鐮孢菌的分離頻率較高，但對玉米的致病性不及禾谷鐮孢菌。

綜上所述，四川省玉米大豆套作系統(tǒng)下，鐮孢菌所引起的玉米莖腐病田間發(fā)病率不高，鐮孢菌群體與國內(nèi)其他省份存在差異，但禾谷鐮孢菌仍為強(qiáng)致病菌，對于該地區(qū)玉米莖腐病的發(fā)生具有潛在威脅。同時，玉米大豆帶狀套作栽培可降低玉米莖腐病的發(fā)生，減少化學(xué)農(nóng)藥使用量，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益，為本地區(qū)玉米生產(chǎn)提供了有價值的參考。