梅磊，朱曄，肖欽之，陳進(jìn)紅，祝水金*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院作物科學(xué)研究所，杭州310058；2.劍橋大學(xué)植物系，英國(guó)劍橋CB23EA；3.邵陽(yáng)市煙草專賣局，湖南邵陽(yáng)422000）

植物在生活期從環(huán)境中吸收和利用各種必需金屬元素的同時(shí)，會(huì)不可避免地?cái)z入某些有害重金屬元素。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇與進(jìn)化，植物擁有了一套復(fù)雜而精細(xì)的應(yīng)對(duì)有害重金屬的策略，其中，通過(guò)合成配體小分子化合物與之絡(luò)合并固定到類似于液泡等細(xì)胞特定區(qū)域的方式，在植物保持體內(nèi)金屬離子平衡的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[1]。在多種植物及真菌中發(fā)現(xiàn)的植物絡(luò)合素（phytochelatin,PC）是一類由酶促反應(yīng)合成的、富含半胱氨酸（cysteine,Cys）的多肽，被認(rèn)為是植物解除重金屬毒害的最重要的小分子化合物之一。植物絡(luò)合素具有(γ-Glu-Cys)n-X（其中n為2～11，X可以缺失或以Gly、β-Ala、Ser、Clu和Cln這5種形式存在）的一般結(jié)構(gòu)通式，能以胱氨酸（cystine）的巰基與重金屬發(fā)生絡(luò)合作用而實(shí)現(xiàn)解毒[1-3]。植物絡(luò)合素在植物或者酵母體內(nèi)以谷胱甘肽（glutathione,GSH）為前體，由植物絡(luò)合素合酶（phytochelatin synthase,PCS,EC 2.3.2.15）催化合成。自GRILL等[4]于1989年首次從膀胱麥瓶草中鑒定到植物絡(luò)合素合酶的活性以來(lái)，該酶的同源物和基因陸續(xù)在數(shù)十種物種中被鑒定發(fā)掘，極大地豐富了人類對(duì)PCS功能的認(rèn)知。結(jié)合前人的研究成果，本文從PCS的雙功能酶特性、基因表達(dá)和酶學(xué)特征、物種分布和親緣關(guān)系、催化活性中心及激活模式5個(gè)方面作簡(jiǎn)要評(píng)述。

1 PCS雙功能酶特性

一直以來(lái)，人們普遍認(rèn)為PCS只具有以谷胱甘肽為底物催化合成植物絡(luò)合素的作用[5]。PCS催化2個(gè)GSH分子間的N-基末端和C-基末端生成由α-酰胺鍵連接的(γ-Glu-Cys)2-Gly和另一個(gè)Gly分子，在后續(xù)的過(guò)程中催化(γ-Glu-Cys)n－1-Gly分子連接GSH中的γ-Glu-Cys部分形成PCn（n=2～11）寡聚體，同時(shí)生成1個(gè)Gly分子；在這個(gè)過(guò)程中，PCS行使γ-谷氨酰半胱氨酸二肽轉(zhuǎn)移酶（transpeptidase）的功能（圖1）[2,5-6]。VATAMANIUK等[3]于1999年將從擬南芥中分離的PCS1酶基因轉(zhuǎn)移到釀酒酵母中，其酶蛋白作為γ-谷氨酰半胱氨酸二肽轉(zhuǎn)移酶催化合成PC，然后，植物絡(luò)合素合成酶的γ-谷氨酰半胱氨酸二肽轉(zhuǎn)移酶作用被大量報(bào)道[3,7-11]。幾乎在所有植物中均發(fā)現(xiàn)了植物絡(luò)合素合成酶基因的存在，即使在偏遠(yuǎn)無(wú)污染地區(qū)的植物中也一樣存在該酶蛋白的表達(dá)?？茖W(xué)家們對(duì)于植物在無(wú)需解毒的情況下也“愿意浪費(fèi)”如此多的能量在該酶參與的通路中產(chǎn)生疑慮，促使了植物絡(luò)合素合成酶肽酶作用的發(fā)現(xiàn)。在此酶促反應(yīng)中，植物絡(luò)合素合酶起著植物特有肽酶的作用，從谷胱甘肽配合物（GS-conjugates）中剪切掉羧基端的甘氨酸殘基，從而得到相應(yīng)的γ-谷氨酰半胱氨酸結(jié)合物（γ-EC-conjugate）。BLUM等[12]在2007年用異源生物的雙滿（xenobiotic bimane，巰基結(jié)合熒光劑）追蹤谷胱甘肽配合物在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)擬南芥PCS1基因缺失系中γ-EC-bimane缺失，該突變體恢復(fù)系中相應(yīng)的γ-EC-bimane得到恢復(fù)，很好地支持了該酶具有肽酶副功能的猜想[5]。

圖1 植物中植物絡(luò)合素的生物合成[2,5-6]Fig.1 Biosynthesis of phytochelatin in plants[2,5-6]

2 PCS基因表達(dá)和酶學(xué)特性

早期的研究表明，PCS基因的表達(dá)是組成型的，在PC合成過(guò)程中不存在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[1]。AtPCS1表達(dá)產(chǎn)物的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和RNA印跡法（Northern blotting）結(jié)果均表明，Cd2+（鎘離子）存在與否對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯影響，且在不同組織部位（葉或根）中的表達(dá)也沒(méi)有明顯差異[3]，相同的結(jié)果也在番茄中被發(fā)現(xiàn)[13]。然而，后期的一些研究表明，PCS基因的表達(dá)也可能受Cd2+的輕微差異化調(diào)控。LEE等[14]將AtPCS1啟動(dòng)子與GUS基因相連后，檢測(cè)到5天齡擬南芥經(jīng)50 mmol/L Cd2+處理5 d后的GUS活性比對(duì)照提高了1倍，后期差異逐漸消失，表明AtPCS1的表達(dá)在植物發(fā)育早期受Cd2+正調(diào)控；馮保民等[1]也初步認(rèn)為在大蒜中PCS基因表達(dá)可能受Cd2+和As3+（銫離子）的影響而上調(diào)，但更深入的研究未見(jiàn)報(bào)道。最初翻譯合成的PCS沒(méi)有催化活性，其催化活性受誘導(dǎo)PC合成的金屬離子激活，但不同金屬離子激活效率差異很大[4]。Cd2+被認(rèn)為是最強(qiáng)的激活劑，其對(duì)PCS的激活效率是Pb2+（鉛離子）的50倍，其次是Ag+（銀離子）、Bi3+（鉍離子）、Pb2+、Zn2+（鋅離子）、Cu2+（銅離子）、Hg+（汞離子）、AuCl4－（四氯合金絡(luò)陰離子）等，而Na+（鈉離子）、K+（鉀離子）、Ca2+（鈣離子）、Mg2+（鎂離子）等則對(duì)PCS沒(méi)有激活作用[1,4]。PCS的激活特性起著調(diào)節(jié)植物體內(nèi)PC水平的作用，該催化合成是一個(gè)自身反饋環(huán)（selffeedback loop）：一旦植物體內(nèi)重金屬離子含量超過(guò)閾值濃度，PCS將被激活，從而產(chǎn)生更多的PC與重金屬進(jìn)行絡(luò)合，降低細(xì)胞內(nèi)重金屬離子水平；當(dāng)重金屬離子濃度降低后便失去了激活PCS的能力，進(jìn)而減少了PC的合成。有報(bào)道表明，當(dāng)Cd2+濃度以低于2∶1的摩爾比結(jié)合PC中的Cys殘基時(shí)，PCS的催化活性趨于停止[1,5]。

3 PCS物種分布及親緣關(guān)系

最早普遍認(rèn)為植物絡(luò)合素合酶只存在于植物中[4]，之后在酵母、小麥和擬南芥中的植物絡(luò)合素合酶基因幾乎同時(shí)被克隆分離出來(lái)，顛覆了早期人們對(duì)PCS的認(rèn)知[5]；后來(lái)從藻青菌（Nostoc sp.PCC 7120）[15]、錫蘭鉤口線蟲（Caenorhabditis elegans）[16]和小眼蟲（Euglena gracilis）[17]中也相繼分離鑒定出PCS，可見(jiàn)PCS可能是廣泛存在于自然界中的，不過(guò)到目前為止還未有從高等動(dòng)物中分離出PCS的相關(guān)報(bào)道。自膀胱麥瓶草PCS被報(bào)道以來(lái)，已有近100種PCS或相關(guān)基因被預(yù)測(cè)或鑒定出來(lái)，其中具有代表性和研究較為深入的物種有擬南芥[3,7,18]、小麥[11,19-20]、大豆[21]、土豆[22]、煙草[10,23]和水稻[24-26]等（表1）。這些PCS具有同源性N-基端高于C-基端的特點(diǎn)，N、C兩端分別具有1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中N-端保守結(jié)構(gòu)域?yàn)樵撁傅墓δ苤行模╬fam05023），C-端結(jié)構(gòu)域含有1個(gè)功能未知的保守結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為可能具有增強(qiáng)酶活性的功能（pfam09328），C-端保守結(jié)構(gòu)域的保守性低于N-端保守結(jié)構(gòu)域[27]。大部分物種的PCS均由長(zhǎng)度為414～505 aa（氨基酸）組成，其中植物均同時(shí)含有PCS必備的N-基端保守結(jié)構(gòu)域（pfam05023）和C-基端保守結(jié)構(gòu)域（pfam09328）。在NCBI基因庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)長(zhǎng)度為226 aa的以O(shè)sPCS2b命名的短片段，經(jīng)比對(duì)分析，認(rèn)為可能是由OsPCS2a基因片段丟失造成的，需要進(jìn)一步核實(shí)。粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）[28]、錫蘭鉤口線蟲（C.elegans）[16]和小眼蟲（E.gracilis）[17]具有C-端氨基酸殘基鏈，但沒(méi)發(fā)現(xiàn)PCS共有的C-端保守結(jié)構(gòu)域（pfam09328）；藻青菌（Nostoc sp.PCC 7120）只單獨(dú)含有一個(gè)長(zhǎng)度為242 aa的N-端催化中心[15]。由圖2可知，植物間PCS具有較高的相似性，同源性較高。擬南芥中2個(gè)旁系同源蛋白AtPCS1和AtPCS2的相似性達(dá)74%，水稻中2個(gè)旁系同源蛋白OsPCS和OsPCS2a的相似性達(dá)69.5%，大豆、田菁屬、擬南芥和芥菜直系同源蛋白GmhPCS1、SrPCS、BjPCS1和AtPCS1/AtPCS2的相似性為65%～92%，煙草和土豆直系同源PCS蛋白的相似性高達(dá)91%，蓮藕、金魚藻、水稻和小麥直系同源蛋白間的相似性為52%～78%；而酵母、線蟲、小眼蟲和藻青菌直系同源PCS間的相似性均較低，為26%～30%，且它們與植物類PCS的相似性也相對(duì)較低，這可能是這些生物體抗重金屬能力低于植物的原因之一。可見(jiàn)，PCS在植物對(duì)周圍環(huán)境的適應(yīng)中可能有著更加復(fù)雜和重要的意義。

表1 PCS在物種中的鑒定和克隆Table 1 Identification and cloning of PCS in species

4 PCS催化中心的研究進(jìn)展

圖2 代表性物種中PCS親緣關(guān)系樹和特征保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Polygenetic tree and conserved domains of PCS in representative species

研究的深入為N-基端是PCS的催化中心提供了有力證據(jù)：1）N-基端保守性明顯高于C-基端；2）藻青菌中只含有N-基端片段，然而仍然具有PCS酶活性（盡管活性較弱）；3）擬南芥突變體cad1-5等位基因編碼的蛋白終止于280氨基酸殘基處，僅為野生型蛋白長(zhǎng)度的3/5，其N-基端未發(fā)生突變，仍然表現(xiàn)出一定的Cd2+抗性，可見(jiàn)突變產(chǎn)物仍舊保留了部分催化活性（合成PCS的能力為野生型的33%）；4）擬南芥中N-基端發(fā)生突變的突變體cad1-1、cad1-3和cad1-4對(duì)Cd2+的敏感性明顯比cad1-5強(qiáng)[4,7]。藻青菌PCS為只含有N-基端催化中心的、長(zhǎng)度為242 aa的短結(jié)構(gòu)，為解析PCS蛋白空間結(jié)構(gòu)域提供了理想材料。REA等[39]于2004年提出PCS酶活性中心可能類似于木瓜蛋白酶超家族的猜想，這個(gè)猜測(cè)翌年被VIVARES等[40]通過(guò)對(duì)藻青菌PCC 7120的PCS蛋白進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)解析而得到證明。藻青菌PCC 7120的PCS是由2個(gè)新月形的單體組成的二聚體，空間大小均大概為50×30×30 ?，PCS二聚體一共含有8個(gè)α螺旋和6個(gè)β折疊條（圖3A）；PCS的酶活性位點(diǎn)與木瓜蛋白酶的酶活性位點(diǎn)表現(xiàn)出高度相似性，這些酶激活區(qū)功能相似的氨基酸殘基是二者具有相似作用機(jī)制的重要基礎(chǔ)[39]，其中典型氨基酸殘基在NsPCS和木瓜蛋白酶的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)分別有Gln64和Gln19，Cys70和Cys25，Arg173和Ala136，His183和His159，Asp201和 Asn175，Ser203 和 Trp177（圖3B）[41]。在?；ㄞD(zhuǎn)肽）過(guò)程中，NsPCS中參與γ-EC形成氫鍵的氨基酸殘基有Cys70、Met123、Gly182、Asp225和Arg232（圖3C和D），其中酶催化位點(diǎn)中最重要的3個(gè)氨基酸殘基為Cys70、His183和Asp201，他們?cè)诳臻g結(jié)構(gòu)上形成結(jié)合底物的“小洞”，這2種類型的氨基酸殘基在真核生物（表1）和原核生物（酵母和藻青菌等）中都嚴(yán)格保守（圖4），可見(jiàn)這些位點(diǎn)在PC形成過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。

5 PCS的活化模式

圖3 PCS活性N-端催化中心蛋白的空間結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)肽作用位點(diǎn)Fig.3 Spatial structures and enzyme active-sites from N-terminal catalytic center of PCS

圖4 物種中代表性PCS的N-基端點(diǎn)序列與功能位點(diǎn)對(duì)比Fig.4 N-terminal sequence alignment and structural site interpretation of selected and representative PCS in organisms

半胱氨酸（cysteine,Cys）是20種氨基酸中唯一含有巰基的氨基酸，可以與重金屬通過(guò)巰基實(shí)現(xiàn)不同形式的結(jié)合，許多金屬結(jié)合原件具有富含Cys殘基的特征，在有金屬參與的生命過(guò)程中扮演著重要角色。富含特征Cys是PCS的重要特征之一，Cys被認(rèn)為與PCS的激活有關(guān)，其在不同物種中和N、C-基端的分布呈現(xiàn)明顯的差異化。在植物PCS中，除擬南芥旁系同源AtPCS2只含有13個(gè)Cys外，其他PCS均包含18～22個(gè)Cys，這可能是AtPCS2酶催化效率低于AtPCS1的原因；酵母和線蟲PCS的Cys含量分別為18和22個(gè)，小眼蟲為13個(gè)，而PCS酶催化活性低的藻青菌只含2個(gè)。PCS中Cys分布的另一個(gè)特征就是成對(duì)在N和C-基端出現(xiàn)，該特征在C-基端表現(xiàn)更為明顯。隨著對(duì)N-基端催化結(jié)構(gòu)的解析和對(duì)越來(lái)越多物種PCS基因克隆研究的深入，PCS激活機(jī)制逐步形成了兩大假說(shuō)。一種認(rèn)為重金屬直接與N-基端酶活性中心的Cys結(jié)合，激活PCS活性，此外，C-基端的Cys也能與重金屬結(jié)合，通過(guò)空間構(gòu)想的改變，將重金屬送到離活性中心更近的位置。這個(gè)假說(shuō)很好地解釋了為什么物種中N-基端保守性都非常高，而C-基端只要求含有數(shù)個(gè)Cys殘基。另一種假說(shuō)認(rèn)為重金屬離子并不直接接觸PCS，而是通過(guò)一種雙底物反應(yīng)模式合成PC，與此同時(shí)，金屬離子也可能直接結(jié)合在PCS的Cys殘基上以促進(jìn)反應(yīng)。該假說(shuō)中第一和第二底物分別是GSH和GSH巰基結(jié)合物。第一底物分子上的Cly殘基脫落分離，產(chǎn)生中間產(chǎn)物γ-谷氨酰半胱氨?；鵓CS結(jié)合體（γ-EC acyl-PCS），然后中間產(chǎn)物的γ-EC基團(tuán)轉(zhuǎn)移到第二個(gè)底物分子上產(chǎn)生雙γ-EC基團(tuán)，最后被從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)送到液泡中。VATAMANIUK等[3,35]通過(guò)構(gòu)建AtPCS1-FLAG（擬南芥PCS1的C-基末端融合了一段DYKDDDDK的標(biāo)記肽）發(fā)現(xiàn)，體外反應(yīng)體系中金屬離子與GSH或PCS的結(jié)合比與AtPCS1-FLAG的結(jié)合穩(wěn)定得多，而且在完全不含金屬離子的條件下，AtPCS-FLAG仍然能夠以S-烷基-GSH為底物催化合成S-烷基-PC2，間接地證明了第二種假說(shuō)的合理性。

6 展望

從目前的研究來(lái)看，PCS作為植物絡(luò)合素合酶的功能已被普遍證實(shí)，而基于該功能的基因表達(dá)模式、酶的活化模式及在不同物種中的差異性等在學(xué)界還存在嚴(yán)重分歧。PCS的肽酶特性的發(fā)現(xiàn)豐富了我們對(duì)PCS的認(rèn)識(shí)與理解，但至今仍缺乏直接的關(guān)于該肽酶引起生物體內(nèi)（植物）生理活動(dòng)與表型變化的直接證據(jù)。而最新的研究表明，擬南芥AtPCS1突變體在面對(duì)生物脅迫時(shí)的非宿主抗性免疫系統(tǒng)遭受破壞，這可能是由于PCS作為肽酶參與到與之相關(guān)的吲哚、硫苷代謝途徑中，且參與相關(guān)微生物維持養(yǎng)分平衡[5]。許多文獻(xiàn)表明，PCS在植物中呈組成型表達(dá)，即無(wú)論有無(wú)外刺激物，植物中的轉(zhuǎn)錄量始終維持在較高水平，從而認(rèn)定其在植物對(duì)重金屬抗性作用中的差異主要由后期蛋白活性的調(diào)控決定，這也是目前的主流觀點(diǎn)。盡管PCS的雙功能酶特性從側(cè)面支持了PCS在植物中持續(xù)高表達(dá)的合理性，但PCS家族基因的表達(dá)在某些物種中也受到不同重金屬離子的調(diào)控，反映出該酶基因可能不是簡(jiǎn)單的組成型表達(dá)，而是具有“組成誘導(dǎo)型”表達(dá)的特點(diǎn)，即在溫和條件下這些基因本生具有相對(duì)較高的表達(dá)量，而在外界刺激下，它們的表達(dá)又能受到進(jìn)一步調(diào)控，這與傳統(tǒng)意義上的平時(shí)低表達(dá)或不表達(dá)、刺激后大量表達(dá)的“誘導(dǎo)型表達(dá)”存在明顯差別。植物絡(luò)合素合酶在未經(jīng)活化時(shí)不具有生物酶活性，其中關(guān)于重金屬離子直接和不直接接觸PCS活化的假設(shè)都有各自的證據(jù)，且并不能相互否認(rèn)，據(jù)此推測(cè)PCS的活化極有可能同時(shí)存在以上2種模式。

植物體內(nèi)植物絡(luò)合素含量被認(rèn)為和重金屬污染程度密切相關(guān)。美國(guó)東部森林蓑萎樹木體內(nèi)PC含量均高于正常樹木，水蘚（Fontinalis antipyretica）中PC含量水平表現(xiàn)為與Cd2+水平呈依賴性劑量表達(dá)的動(dòng)力學(xué)關(guān)系，長(zhǎng)心卡帕藻（Kappaphycus alvarezii）中的PC含量隨著暴露在Cd2+中的時(shí)間延長(zhǎng)而增加，這些都為PC可作為環(huán)境重金屬污染的生物指示劑提供了強(qiáng)力證據(jù)。植物體內(nèi)PC含量除與金屬差異誘導(dǎo)相關(guān)外，還呈現(xiàn)出由PCS引起的物種差異性，因而深入研究PCS催化機(jī)制和活性特征對(duì)于PC作為重金屬污染的生物指示劑具有重要意義[4]。據(jù)GRILL等[42]在1985的報(bào)道，蛇根木（Rauvolfia serpentina）細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液在200μmol/L CdSO4（硫酸鎘）脅迫下，90%以上吸收的重金屬被植物絡(luò)合素所吸附，可見(jiàn)植物絡(luò)合素在植物主動(dòng)抗重金屬脅迫過(guò)程中占主導(dǎo)地位。因此，通過(guò)生物工程學(xué)手段，在糧食作物中抑制表達(dá)或者敲除PCS基因，創(chuàng)造重金屬敏感作物，可降低可食用部分重金屬含量。對(duì)于PCS基因抑制表達(dá)后對(duì)重金屬表現(xiàn)為超級(jí)敏感的工程植物，可以開發(fā)為重金屬污染土壤指示物；相應(yīng)地，通過(guò)PCS過(guò)表達(dá)工程植物的創(chuàng)制，篩選獲得強(qiáng)重金屬吸附能力植物，是對(duì)重金屬污染土壤進(jìn)行植物修復(fù)的強(qiáng)有力措施。最后，作為富含Cys氨基殘基的金屬相關(guān)功能酶，PCS與金屬的作用具有典型性，對(duì)我們研究鋅指類蛋白（Cys與重金屬Zn作用）等諸多金屬結(jié)合原件的調(diào)控作用具有借鑒意義。

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