柳夢(mèng)琪，張廣路，郭長(zhǎng)權(quán)，楊婷宇，米玉玲

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310058）

鎘（cadmium,Cd）是工業(yè)制造中廣泛使用的一種重金屬，通過(guò)廢水、廢氣和廢渣的形式釋放到環(huán)境中，引起水、空氣和土壤的污染[1]。鎘作為人體的非必需元素，可以通過(guò)職業(yè)性接觸、呼吸和食用被鎘污染的食物進(jìn)入人體，通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)機(jī)體各器官，危害人體健康。日本“痛痛病”和湖南“鎘大米”事件使人們聚焦于鎘引起的環(huán)境污染問(wèn)題。鎘已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）列為重點(diǎn)研究的食品污染物，同時(shí)被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer,IARC）認(rèn)定為Ⅰ類致癌物[2-3]。慢性鎘暴露可導(dǎo)致小鼠生殖系統(tǒng)出現(xiàn)鎘積累，并對(duì)生殖系統(tǒng)的發(fā)育造成嚴(yán)重?fù)p傷[4]；鎘暴露也可引起曲細(xì)精管中生殖細(xì)胞的凋亡[5]；另外還有研究發(fā)現(xiàn)，鎘能夠降低男性精液的質(zhì)量，使生殖能力下降[6]。然而，關(guān)于鎘作為毒物引起生殖系統(tǒng)損傷的機(jī)制仍不清楚。

?；撬幔╰aurine,Tau）作為一種天然氨基酸，不參與蛋白質(zhì)生物合成，主要存在于富含蛋白質(zhì)的食物中。?；撬峋哂薪笛獕?、降血脂、維持滲透壓平衡和抗氧化等生物學(xué)作用。在低溫儲(chǔ)藏的條件下，在牛精液中添加?；撬峥娠@著增強(qiáng)精子的生存能力[7]；清除過(guò)氧化氫產(chǎn)生的羥基自由基，從而保護(hù)精子免受氧化損傷[8]。然而，有關(guān)?；撬岜Ｗo(hù)睪丸的作用機(jī)制報(bào)道很少。

活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平是疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)，可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)多種防御系統(tǒng)。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factorerythroid 2 related factor-2,Nrf2）是細(xì)胞防御機(jī)制中維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。Nrf2在正常生理?xiàng)l件下呈現(xiàn)低水平表達(dá)，然而在非正常條件下，如在癌細(xì)胞中可呈現(xiàn)高水平表達(dá)[9]，說(shuō)明Nrf2的激活對(duì)人類疾病的預(yù)防意義重大。血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）是Nrf2調(diào)節(jié)的下游因子。機(jī)體受到氧化應(yīng)激后，Nrf2從胞質(zhì)入核與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合，從而激活Nrf2及其下游因子HO-1的表達(dá)。大量報(bào)道指出，鎘可激活Nrf2信號(hào)通路[10-13]，但?；撬釋?duì)鎘誘導(dǎo)的生殖系統(tǒng)氧化損傷的緩解作用與Nrf2/HO-1信號(hào)通路是否相關(guān)仍然未知。

本研究采用雞胚睪丸生殖細(xì)胞-體細(xì)胞共培養(yǎng)模型，探究無(wú)機(jī)內(nèi)分泌干擾物鎘誘導(dǎo)的雞胚睪丸細(xì)胞毒性，研究鎘誘導(dǎo)的睪丸細(xì)胞氧化損傷與Nrf2/HO-1信號(hào)的相關(guān)性，為合理開(kāi)發(fā)抗氧化物質(zhì)牛磺酸防治鎘引起的生殖毒性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

氯化鎘、?；撬幔?gòu)自Aladdin公司；四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）試劑盒、丙二醛（malonaldehyde,MDA）試劑盒、H2O2試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick end labelling,TUNEL）細(xì)胞凋亡試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司；RIPA裂解液（RIPA lysis buffer）、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）、Western一抗和二抗稀釋液，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU），購(gòu)自Sigma公司；BrdU一抗G3G4，購(gòu)自DSHB公司；兔抗CDK2，購(gòu)自武漢博士德生物公司；鼠抗PCNA、β-actin，購(gòu)自Abcam公司；TRIFC標(biāo)記羊抗鼠二抗、TRIFC標(biāo)記羊抗兔二抗，購(gòu)自巴傲得生物科技有限公司；兔抗Nrf2、兔抗p-Nrf2，購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑，購(gòu)自Invitrogen公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）上樣緩沖液，購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）和常規(guī)化學(xué)試劑（均為分析純），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；海蘭雞受精種蛋，購(gòu)自杭州市蛋雞試驗(yàn)場(chǎng)。

1.2 睪丸細(xì)胞的處理

受精種蛋在溫度38.5℃和濕度60%的孵化箱中孵化至18日，參照MI等[14]的研究方法將睪丸分散成單個(gè)細(xì)胞，分別按每孔5×104、2×105、1×106個(gè)的細(xì)胞密度接種到96、24和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。牛磺酸和鎘用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS）配制成貯備液，并將培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。用鎘（1.25、2.50、5.00 μmol/L）和牛磺酸（10、100、1 000 μmol/L）分別或者聯(lián)合處理睪丸細(xì)胞。

1.3 睪丸生殖細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

不同處理組的睪丸細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，于顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)狀態(tài)，采用顯微數(shù)字成像系統(tǒng)拍照，每孔選4個(gè)視野，通過(guò)圖像分析軟件對(duì)生殖細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè)

不同處理組的睪丸細(xì)胞在96孔板培養(yǎng)48 h后，加入20 μL MTT溶液，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，在搖床上低速振蕩5 min，然后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量其吸光度。細(xì)胞存活率=（測(cè)定組吸光度值－空白組吸光度值）/（對(duì)照組吸光度值－空白組吸光度值）。

1.5 生化指標(biāo)測(cè)定

不同處理組的睪丸細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用于生化分析。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定 SOD、MDA、H2O2和ROS。SOD、MDA和H2O2在酶標(biāo)儀中檢測(cè)。ROS在熒光酶標(biāo)儀上檢測(cè)：測(cè)定前設(shè)置空白對(duì)照組，ROS水平等于測(cè)定的細(xì)胞熒光強(qiáng)度與對(duì)照組熒光強(qiáng)度的比值。

1.6 BrdU摻入及檢測(cè)

將BrdU摻入細(xì)胞，使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)不同處理組的睪丸細(xì)胞增殖情況。不同處理組的睪丸細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)44 h后摻入BrdU，在38.5℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min，用含吐溫－20的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline with Tween－20,PBST）洗3次，在2 mol/L HCl、37℃條件下變性30 min。加入0.1 mol/L四硼酸鈉中和5 min，PBST洗3次后，用即用型山羊血清常溫封閉20 min。添加BrdU一抗G3G4（1∶200）4 ℃孵育過(guò)夜，用PBST洗3次，加入TRIFC標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶500）在37℃條件下孵育1 h，用PBST洗3次。最后，加入DAPI常溫孵育30 min，PBST洗3次。在IX70熒光顯微鏡下觀察，通過(guò)BrdU標(biāo)記的睪丸細(xì)胞核與DAPI染色的睪丸細(xì)胞核比值計(jì)算BrdU摻入指數(shù)。

1.7 TUNEL染色

依據(jù)TUNEL試劑盒操作方法檢測(cè)不同處理組的睪丸細(xì)胞凋亡情況，在IX70熒光顯微鏡下觀察、拍照。通過(guò)TUNEL陽(yáng)性標(biāo)記的睪丸細(xì)胞核與DAPI染色的睪丸細(xì)胞核比值計(jì)算TUNEL陽(yáng)性標(biāo)記率。

1.8 免疫熒光染色

不同處理組的睪丸細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)48 h，用4%多聚甲醛固定20 min。然后用PBST通透細(xì)胞，用山羊血清封閉。添加兔抗Nrf2抗體（1∶100）和兔抗p-Nrf2抗體（1∶100）4℃孵化過(guò)夜。將TRIFC標(biāo)記羊抗兔二抗（1∶500）作為二抗。最后用DAPI常溫孵育10 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

1.9 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法

不同處理組的睪丸細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)48 h，用1 mL RIPA（含1 mmol/L苯甲基磺酰氟）進(jìn)行裂解。根據(jù)二喹啉甲酸（BCA）試劑盒中的操作步驟測(cè)定不同處理組的總蛋白量。在保持蛋白上樣量一致情況下，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，加入兔抗CDK2，鼠抗PCNA，兔抗Nrf2和兔抗p-Nrf2抗體4℃孵育過(guò)夜。采用辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h?；厥斩购笙茨?遍，用ECL曝光拍照。以β-actin（1∶1 000）為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析。

1.1 0RNA提取、cDNA合成及熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time fluorescent PCR,qRT-PCR）用于檢測(cè)基因mRNA的表達(dá)。用TRIzol試劑提取總RNA，用Nano Drop儀測(cè)定RNA濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟，將不同處理組的RNA統(tǒng)一反轉(zhuǎn)錄成2 μg的cDNA，在定量PCR儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)?？傮w系（20μL）為：2μL cDNA模板，0.4μL Rox參比染料Ⅱ，400 nmol/L特異性引物（表1）和10μL SYBR Premix Ex Taq。以β-actin為內(nèi)參，采用相對(duì)定量（2－ΔΔCT）法計(jì)算基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primers for quantitative real-time fluorescent PCR

1.1 1 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用SPSS 23.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、最小顯著差數(shù)法（least-significant difference,LSD）和鄧肯（Duncan）多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；撬峋徑怄k引起的雞胚睪丸細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

在生殖細(xì)胞-體細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，不同濃度的鎘均對(duì)生殖細(xì)胞呈現(xiàn)出毒性作用。在對(duì)照組中，生殖細(xì)胞呈圓形并且附著于體細(xì)胞之上（圖1A-a）。在2.50 μmol/L鎘處理組中，生殖細(xì)胞呈現(xiàn)胞質(zhì)空泡化（圖1A-c）；添加5.00 μmol/L鎘后，許多生殖細(xì)胞凋亡成細(xì)胞碎片（圖1A-d）。?；撬崽幚斫M（100 μmol/L）的生殖細(xì)胞生長(zhǎng)良好，體細(xì)胞呈梭狀鋪滿培養(yǎng)板，生殖細(xì)胞呈圓形貼于體細(xì)胞上（圖1A-e）；?；撬岷玩k聯(lián)合處理組的生殖細(xì)胞形態(tài)良好（圖1A-f）。

鎘處理雞胚睪丸細(xì)胞48 h后，睪丸生殖細(xì)胞數(shù)目顯著降低（P＜0.05），然而?；撬岷玩k聯(lián)合處理組生殖細(xì)胞數(shù)顯著高于鎘處理組（P＜0.05），損傷水平顯著降低（圖1B）。1.25、2.50、5.00 μmol/L鎘處理組的細(xì)胞活力分別為85.4%、80.1%和72.6%（圖1C），均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），表明雞胚睪丸細(xì)胞活性隨著鎘濃度增加而依賴性降低，細(xì)胞損傷加重，此時(shí)的細(xì)胞活性主要來(lái)自于體細(xì)胞。用牛磺酸（10、100、1 000 μmol/L）與鎘（2.50 μmol/L）進(jìn)行聯(lián)合處理后，MTT檢測(cè)結(jié)果（圖1D）表明，100 μmol/L牛磺酸將2.50 μmol/L鎘誘導(dǎo)的睪丸細(xì)胞活力由80.1%提升至86.05%，表明100 μmol/L牛磺酸可緩解2.50 μmol/L鎘誘導(dǎo)的睪丸細(xì)胞毒性。

2.2 牛磺酸和鎘對(duì)睪丸細(xì)胞氧化損傷的影響

用?；撬幔?00 μmol/L）和鎘（2.50 μmol/L）單獨(dú)或聯(lián)合處理的睪丸細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，測(cè)定其MDA含量、H2O2水平和SOD活性，以揭示睪丸細(xì)胞氧化損傷情況。由圖2可知：在牛磺酸處理組中，H2O2水平和SOD活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但MDA含量顯著減少（P＜0.05）；在鎘處理組中，MDA含量和H2O2水平與對(duì)照組相比顯著增加，SOD活性顯著降低（P＜0.05）；?；撬岷玩k聯(lián)合處理組與鎘處理組相比，其MDA含量降低，SOD活性增加。

圖1 ?；撬幔═au）和鎘對(duì)雞胚睪丸細(xì)胞的影響Fig.1 Effects of taurine(Tau)and cadmium on testicular cells in embryonic chicken

采用熒光探針DCFH-DA對(duì)睪丸細(xì)胞進(jìn)行ROS檢測(cè)，結(jié)果（圖2C）表明：與對(duì)照組相比，?；撬崽幚斫M中ROS生成量無(wú)顯著性差異，鎘處理組的ROS生成量顯著增加（P＜0.05）；?；撬岷玩k聯(lián)合處理組的ROS生成量低于鎘處理組，但差異不顯著。

圖2 ?；撬岷玩k對(duì)睪丸細(xì)胞氧化和抗氧化系統(tǒng)的影響Fig.2 Effects of taurine and cadmium on oxidation and antioxidant system in testicular cells of embryonic chicken

2.3 ?；撬岷玩k對(duì)睪丸細(xì)胞增殖的影響

通過(guò)BrdU摻入試驗(yàn)檢測(cè)不同處理組睪丸細(xì)胞增殖狀況，結(jié)果（圖3A、C）表明：對(duì)照組中約18.7%的睪丸細(xì)胞被BrdU標(biāo)記，然而鎘處理組睪丸細(xì)胞標(biāo)記率低至8.8%；與對(duì)照組相比，鎘處理組中BrdU標(biāo)記率顯著降低（P＜0.05），而?；撬岷玩k聯(lián)合處理組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)（圖3B），結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，增殖相關(guān)蛋白CDK2（圖3D）和PCNA（圖3E）在鎘處理組中顯著減少（P＜0.05），然而在?；撬岷玩k聯(lián)合處理組中卻與對(duì)照組無(wú)顯著差異。

2.4 ?；撬岷玩k對(duì)睪丸細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)TUNEL免疫熒光染色檢測(cè)睪丸細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果（圖4A～B）表明：牛磺酸處理組和對(duì)照組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞很少，與對(duì)照組相比，鎘處理組中細(xì)胞凋亡率顯著增加到22.07%；?；撬岷玩k聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡率為9.99%，顯著低于鎘處理組。采用熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果表明：鎘處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因（GRP78和XBP-1）顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），?；撬岷玩k聯(lián)合處理組GRP78和XBP-1低于鎘處理組（圖4C～D）；鎘處理組凋亡相關(guān)基因（Cyt C、caspase 9和 p53）顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），牛磺酸和鎘聯(lián)合處理組Cyt C、caspase 9和p53低于鎘處理組（圖4E～G）。

2.5 ?；撬岷玩k對(duì)睪丸細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)的影響

圖3 ?；撬幔═au）和鎘（Cd）對(duì)睪丸細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of taurine(Tau)and cadmium(Cd)on testicular cell proliferation in embryonic chicken

圖4 ?；撬幔═au）和鎘（Cd）對(duì)雞胚睪丸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的影響Fig.4 Effects of taurine(Tau)and cadmium(Cd)on endoplasmic reticulum stress and apoptosis in testicular cells of embryonic chicken

免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果表明，Nrf2定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，p-Nrf2主要表達(dá)在細(xì)胞核中。從圖5A中可以看出：Nrf2和p-Nrf2在對(duì)照組中微弱表達(dá)；與對(duì)照組相比，Nrf2和p-Nrf2在鎘處理組中呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；在?；撬岷玩k聯(lián)合處理組中，Nrf2和p-Nrf2與對(duì)照組相比無(wú)顯著性變化。采用免疫印跡法對(duì)Nrf2和p-Nrf2的蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果（圖5B）顯示，對(duì)照組中Nrf2和p-Nrf2呈現(xiàn)低表達(dá)。與對(duì)照組相比，Nrf2（圖5C）和p-Nrf2（圖5D）在鎘處理組中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；與鎘處理組相比，?；撬岷玩k聯(lián)合處理組Nrf2和p-Nrf2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果（圖5E）顯示，與對(duì)照組相比，HO-1 mRNA的表達(dá)水平在鎘處理組中顯著升高（P＜0.05），而?；撬岷玩k聯(lián)合處理組HO-1 mRNA的表達(dá)水平顯著低于鎘處理組（P＜0.05）。

3 討論

重金屬鎘是廣泛存在于環(huán)境中的污染物，由于其在人體中的半衰期長(zhǎng)，使得鎘容易蓄積于人體，引起機(jī)體重要器官嚴(yán)重?fù)p傷，其中對(duì)生殖系統(tǒng)損害尤為嚴(yán)重[15-17]。但是目前關(guān)于鎘對(duì)雄性生殖系統(tǒng)損傷作用機(jī)制的報(bào)道較少。我們采用生殖細(xì)胞-體細(xì)胞共培養(yǎng)模型進(jìn)行研究，該模型已經(jīng)被證實(shí)在評(píng)價(jià)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物中有效[18]。鎘作為內(nèi)分泌干擾物可調(diào)節(jié)雄激素受體活性[19]，引起內(nèi)分泌紊亂[20]。鎘能進(jìn)入機(jī)體并積累在睪丸中，進(jìn)而損傷睪丸，使其形態(tài)異常，從而影響生殖系統(tǒng)[21]。高濃度的鎘可影響精子質(zhì)量[22]，由于生殖細(xì)胞對(duì)鎘暴露高度敏感，僅1 μmol/L鎘即可顯著降低生殖細(xì)胞數(shù)[23]。在本研究中，生殖細(xì)胞在鎘暴露后出現(xiàn)核固縮和胞質(zhì)空泡化等現(xiàn)象，表明鎘誘導(dǎo)能使生殖細(xì)胞形態(tài)異常。形態(tài)觀察法和MTT檢測(cè)結(jié)果均表明，牛磺酸（100 μmol/L）對(duì)鎘（2.50 μmol/L）的生殖毒性具有保護(hù)作用。

圖5 牛磺酸（Tau）和鎘（Cd）對(duì)睪丸細(xì)胞Nrf2的影響Fig.5 Nrf2 changes of taurine(Tau)and cadmium(Cd)on testicular cell

在正常情況下機(jī)體的氧化狀態(tài)和抗氧化狀態(tài)維持著動(dòng)態(tài)平衡，但這種平衡隨著年齡的增加而逐漸被打破[24]。睪丸因具有豐富的脈管系統(tǒng)而容易被鎘攻擊[25]，產(chǎn)生的氧化損傷可導(dǎo)致睪丸微循環(huán)的變化[26]。氧化應(yīng)激在半數(shù)不育男性中是比較常見(jiàn)的病理狀態(tài)[27]，鎘可以結(jié)合在氨基酸的巰基上，引起氧化應(yīng)激[28]。為了應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，鎘暴露使抗氧化酶SOD降低[29]。本研究結(jié)果表明，鎘會(huì)引起SOD活性降低，MDA和H2O2水平升高，ROS積累，而添加?；撬峥山档蚏OS，恢復(fù)機(jī)體抗氧化水平，說(shuō)明抗氧化劑?；撬崮芫徑怄k引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

在乳腺癌細(xì)胞中，一定濃度的鎘可促進(jìn)細(xì)胞增殖[30]，其中低濃度鎘能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高濃度鎘則顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[31]。鎘還能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，降低CDK2的表達(dá)[32]。在本研究中，鎘降低了CDK2和PCNA蛋白的表達(dá)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在機(jī)體氧化應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。線粒體產(chǎn)生的ROS過(guò)量，則自由基攻擊膜磷脂及線粒體膜去極化，若線粒體膜孔打開(kāi)，則Cyt C從線粒體進(jìn)入胞質(zhì)，參與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶信號(hào)通路的激活，激活凋亡小體的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9活性。有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路能調(diào)控鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過(guò)程[33-34]。鎘參與線粒體介導(dǎo)的信號(hào)通路[35-36]，所以，鎘誘導(dǎo)的線粒體凋亡與ROS生成及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9的激活有關(guān)。而且鎘可誘導(dǎo)很多類型的細(xì)胞發(fā)生凋亡[37-38]。在本研究中，鎘處理誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因（GRP78和XBP-1）和凋亡相關(guān)基因（Cyt C、caspase 9和p53）的表達(dá)顯著上調(diào)，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率顯著增加，但是?；撬岷玩k聯(lián)合處理后，睪丸細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激得到了改善，細(xì)胞凋亡減少。說(shuō)明?；撬峥赏ㄟ^(guò)抑制細(xì)胞凋亡和恢復(fù)細(xì)胞增殖能力來(lái)緩解鎘的毒性作用。

鎘作為主要的環(huán)境和職業(yè)性污染物很難被消除，所以探究鎘的毒性機(jī)制，研發(fā)抗氧化治療劑尤為重要。而食源性?；撬釋?duì)鎘緩解作用的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚。近年來(lái)，有研究報(bào)道Nrf2是鎘誘導(dǎo)器官毒性損傷的潛在機(jī)制[10-13]。也有報(bào)道顯示，鎘能顯著增加ROS的產(chǎn)生量，介導(dǎo)Nrf2表達(dá)上調(diào)，硒能緩解鎘誘導(dǎo)的器官毒性作用，與Nrf2調(diào)節(jié)的抗氧化信號(hào)通路無(wú)關(guān)[13]。本研究結(jié)果表明，鎘暴露使睪丸細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致ROS積累，介導(dǎo)Nrf2和p-Nrf2蛋白表達(dá)上調(diào)，引起抗氧化基因HO-1的表達(dá)上調(diào)。而添加?；撬峥山档蚏OS水平，緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而使Nrf2和p-Nrf2的蛋白水平趨于正常。

4 結(jié)論

隨著鎘濃度（1.25～5.00 μmol/L）的增加，鎘對(duì)生殖細(xì)胞的毒性作用增強(qiáng)，生殖細(xì)胞形態(tài)和功能損傷嚴(yán)重。5.00 μmol/L鎘能誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性作用而導(dǎo)致細(xì)胞崩解。鎘引起睪丸細(xì)胞氧化損傷，降低睪丸細(xì)胞增殖和增加睪丸細(xì)胞凋亡。鎘暴露使睪丸細(xì)胞中ROS積累，Nrf2蛋白表達(dá)上調(diào)，其下游基因HO-1表達(dá)也上調(diào)。抗氧化劑?；撬崮芫徑怄k誘導(dǎo)的氧化損傷，進(jìn)而使Nrf2和p-Nrf2的蛋白水平趨于正常。?；撬嵋环矫嫱ㄟ^(guò)恢復(fù)氧化與抗氧化平衡，另一方面通過(guò)抑制睪丸細(xì)胞凋亡和恢復(fù)細(xì)胞增殖來(lái)緩解鎘誘導(dǎo)的生殖毒性。

致謝 浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心曾衛(wèi)東老師對(duì)本試驗(yàn)給予了大力幫助，謹(jǐn)致謝意！

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