煙草青枯病發(fā)病煙株根際土壤細菌群落分析

施河麗，向必坤，譚軍，彭五星，孫玉曉，王瑞，吳文昊，魏國勝，丁才夫

湖北省煙草公司恩施州公司，湖北恩施 445000

近年來，根際微生態(tài)系統(tǒng)引起了人們的廣泛關注。根際（rhizosphere）是指受植物根系活動的影響，在物理、化學和生物學性質上不同于土體的微域土區(qū)[1]。在根際這一微域環(huán)境內，植物、土壤和微生物三者相互作用形成獨特的微生態(tài)環(huán)境。微生物是土壤微生態(tài)系統(tǒng)最重要的組成部分，在土壤營養(yǎng)循環(huán)、有機質分解、土壤肥力保持和提高、污染物降解、能量流動以及作物土傳病害的防治等方面起著重要作用[2-4]。微生物相比土壤微生態(tài)系統(tǒng)中的其他成分，對土壤環(huán)境的變化更為敏感[5]。

煙草青枯病是由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的土傳細菌性病害，嚴重危害煙株生長，造成巨大的經(jīng)濟損失，是毀滅性的病害。研究表明，土傳病害的發(fā)生與根際土壤微生物的數(shù)量、區(qū)系和群落結構關系密切[6-7]，是根際土壤微生物群體相互作用的結果。土壤微生物群體可在一定程度上抑制作物的土傳病害，微生物群落結構越豐富，多樣性越高，對抗病原菌的綜合能力越強[8]。通過調節(jié)煙草根際土壤微生態(tài)環(huán)境來抑制土傳病害的發(fā)生已成為研究的熱點，本文從煙草根際土壤微生態(tài)角度出發(fā)，采用宏基因組學高通量測序技術，比較發(fā)病煙株和健康煙株根際土壤細菌群落結構的差異，明確根際土壤細菌群落與土壤環(huán)境因子間的關系，為從根際土壤微生態(tài)調控方面研究煙草青枯病的防控問題奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于湖北省恩施土家族苗族自治州咸豐縣朝陽寺鎮(zhèn)雞鳴壩煙區(qū)，北緯 29°37′，東經(jīng) 108°57′，海拔670 m。土壤類型為黃棕壤，土壤質地為壤土。選取土壤肥力中等、地勢平坦、排灌方便、常年種植烤煙、多年不發(fā)生青枯病和青枯病發(fā)病嚴重的煙田各5塊。在煙株旺長后期，同時也是青枯病發(fā)病高峰期，最終確定不發(fā)生青枯病和發(fā)病率為95%以上的煙田各3塊，健康煙田編號為HRS1～HRS3，發(fā)病煙田編號為DRS1～DRS3。供試烤煙品種為K326。供試土壤基礎理化性質如表1所示。

表1 供試土壤基本理化性質Tab.1 Basic chemical and physical properties of the tested soil

1.2 根際土壤樣品的采集與處理

采樣時間為青枯病發(fā)病高峰期（2016年7月28日），采用多點取樣法，每塊煙田選取8株煙采集根際土壤。用采樣鏟將煙株根系完整挖出，輕敲根系，使與根系結合較松的土壤自然落下后，將與根系緊密結合的土壤連同根系放入自封式取樣袋中，用手輕輕揉捏抖動根系，使與根系結合較緊密的土壤（4 mm內）落入取樣袋中，所采樣品即為根際土壤。將每塊煙田8株煙的根際土壤混合后作為一個樣品，最終得到6個根際土壤樣品。將所采集的根際土壤樣品分為兩份，一份置于冷藏箱中帶回實驗室，于-20℃冰箱中保存，用于提取土壤微生物基因組DNA；另一份根據(jù)測定指標將土樣風干研磨后過不同孔徑的篩，用于測定土壤化學性質。

1.3 根際土壤微生物DNA的提取

根際土壤微生物基因組總DNA采用Fast DNA?SPIN Kit for Soil（Qbiogene，Inc.USA）試劑盒提取。各樣品DNA提取物存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 根際土壤細菌DNA的擴增和測序文庫的建立

擴增細菌16S rRNA的V3-V4 可變區(qū)，采用正向引 物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')， 反向引物806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3')。PCR反應體系：土壤微生物DNA模板（10 ng/μL）2.5 μL，F(xiàn)orward 引物和 Reverse引物（1 μmol/L）各5 μL，KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5 μL。PCR反應條件： 95℃ 3 min ；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，25個循環(huán)；72°C延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、質檢建立測序文庫，再對文庫進行文庫純化、質檢后，送上海伯豪生物技術有限公司，采用MiSeq sequencer (Illumina)進行測序。

1.5 OTU聚類

采用 Mothur (http://www.mothur.org/)軟件將測序序列去重復，與已知數(shù)據(jù)庫GreenGene、Silva等比對，去除嵌合體序列和線粒體、葉綠體序列。計算其距離，并在97%的相似水平下進行OTU聚類。

1.6 根際土壤化學性質測定

采用常規(guī)方法測定根際土壤化學性質。用pH計法（土：水=1:2.5）測定pH；用重鉻酸鉀容量法測定有機質；用擴散法測定堿解氮；用硫酸鉬銻抗比色法測定有效磷；用火焰光度法測定速效鉀；用乙酸銨浸提-原子吸收分光光度法測定土壤交換性鈣、鈉和鎂[9]；采用原子吸收法測定有效鐵、錳、銅和鋅；用沸水浸提-姜黃素比色法測定有效硼[10]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

隨機選取相似度在97%條件下的OTU，利用mothur軟件做rarefaction分析，利用perl語言工具繪制稀釋曲線圖。利用Mothur軟件計算Chao指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)等4種常用的多樣性指數(shù)，測序深度用覆蓋率（Coverage）表示。將部分屬的分類信息進行聚類，利用HemI軟件繪制heatmap圖。利用Excel 2007進行初處理和制圖，采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。利用R語言的VEGAN數(shù)據(jù)包對根際土壤細菌群落結構與土壤環(huán)境因子進行典范對應分析（Canonical Correspondence Analysis）。利用SPSS 22.0軟件進行根際土壤細菌群落結構多樣性和豐度與土壤環(huán)境因子的Spearman相關性分析。

2 結果與分析

2.1 根際土壤測序深度評估

隨機抽取測序序列，將抽到的序列數(shù)與他們所代表OTU的數(shù)目構建曲線，在97%相似性水平下聚類OTU并制作各樣品的稀釋性曲線。從本研究數(shù)據(jù)構建的稀釋性曲線來看（圖1），在測序量增加的初始階段，OTU數(shù)量呈急劇上升趨勢，隨著測序量的不斷增加，OTU數(shù)量的增加基本趨向于平緩，但仍有上升趨勢，表明測序數(shù)量基本合理，可以初步反映根際土壤樣品中的細菌種群構成，但尚有部分微生物未被發(fā)現(xiàn)。

圖1 根際土壤樣品細菌多樣品稀釋性曲線Fig.1 Bacterial rarefaction curves of different rhizosphere soil samples

2.2 根際土壤細菌Alpha多樣性分析

由表2可知，發(fā)病煙株根際土壤細菌OTU數(shù)為4045，健康煙株根際土壤細菌OTU數(shù)為4540，健康煙株根際土壤細菌OTU數(shù)比發(fā)病煙株高12.24%。97%相似度覆蓋率為93.38%～93.84%，表明該數(shù)據(jù)足以解釋根際土壤細菌的多樣性，可反映出真實環(huán)境中細菌群落結構，具有研究意義和實際價值。Ace指數(shù)和Chao指數(shù)可以反映群落物種豐富度，其值越大表明群落物種的豐富度越高。Shannon指數(shù)和 Simpson指數(shù)可以反映群落物種多樣性，其中Shannon指數(shù)值越大，群落多樣性越高；而Simpson指數(shù)值越小，群落多樣性越高[11-12]。本研究表明，健康煙株根際土壤細菌Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)有高于發(fā)病煙株的趨勢，而Simpson指數(shù)有低于發(fā)病煙株的趨勢。

2.3 基于分類地位的群落特征分析

2.3.1 門水平的細菌群落組成

從煙草根際土壤中主要檢測出26個門類的微生物，相對豐度在1%以上的有10個門類，其中變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）為根際土壤的3大優(yōu)勢菌門，在發(fā)病煙株的根際土壤中共占細菌總群落的70.41%，在健康煙株根際土壤中共占細菌總群落的67.90%（圖2）。對發(fā)病煙株和健康煙株根際土壤細菌進行門水平的比較發(fā)現(xiàn)，疣微菌門（Verrucomicrobia）在健康煙株根際土壤中的豐度是其在發(fā)病煙株中的2.28倍；酸桿菌門（Acidobacteria）、 綠 彎 菌 門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和浮霉菌門（Planctomycetes）在健康煙株根際土壤中的豐度比其在發(fā)病煙株中分別高31.67%、2.48%、13.29%和49.36%；另外，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和Candidatus_Saccharibacteria在發(fā)病煙株根際土壤中的豐度比其在健康煙株中分別高16.82%、4.85%、16.88%、27.56%和73.78%。

表2 根際土壤細菌Alpha多樣性統(tǒng)計Tab.2 Statistical analysis of bacterial Alpha diversity in rhizosphere soil

圖2 發(fā)病煙株和健康煙株根際土壤細菌群落在門水平上的組成Fig.2 Composition at the phylum level of the bacterial community in the rhizosphere soil of disease infected plant and healthy plant

2.3.2 屬水平的細菌類群組成

從屬的角度進行heatmap圖譜分析發(fā)現(xiàn)（圖3），Gaiella、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）為根際土壤中的優(yōu)勢菌屬；芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和鏈霉菌屬（Streptomyces）等益生菌在健康煙株根際土壤中的豐度有高于發(fā)病煙株的趨勢；而勞爾氏菌屬（Ralstonia）和Rudaea等病原菌的豐度有低于發(fā)病煙株的趨勢。

圖3 根際土壤樣品細菌OTUs熱圖Fig.3 Heatmap of the bacterial OTUs in the rhizosphere soil samples

將發(fā)病煙株和健康煙株根際土壤中豐度超過0.5%的27個屬進行對比分析發(fā)現(xiàn)（圖4），有13個屬在健康煙株根際土壤中的豐度較高，包括水球菌屬（Aquisphaera）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、康奈斯氏桿菌屬（Conexibacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、沉積巖桿菌屬（Ilumatobacter）、兩面神菌屬（Janibacter）、Kofleria、類諾卡氏屬 (Nocardioides)、 紅游動菌屬（Rhodoplanes）、土壤紅桿菌屬（Solirubrobacter）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和棲熱嗜油菌屬（Thermoleophilum），其中土壤紅桿菌屬（Solirubrobacter）和鞘脂菌屬（Sphingobium）在健康煙株根際土壤中的豐度是其在發(fā)病煙株中的4倍以上，鞘脂菌屬（Sphingobium）和棲熱嗜油菌屬（Thermoleophilum）的豐度顯著高于發(fā)病煙株。有14個屬在發(fā)病煙株根際土壤中的豐度較高，包括酸土單胞菌屬（Aciditerrimonas）、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、慢生根瘤菌屬（Bradyrizobium）、伯克氏菌（Burkholderia）、Gaiella、北里維菌屬（Kitasatospora）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、Pseudolabrys、勞爾氏菌屬（Ralstonia）、根瘤菌屬（Rhizobium）、產(chǎn)黃桿菌屬（Rhodanobacter）、Rudaea、 鞘 氨 醇 單 胞 菌 屬（Sphingomonas）、Thermosporothrix，其中勞爾氏菌屬（Ralstonia）和Rudaea在發(fā)病煙株根際土壤中的相對豐度是其在健康煙株中的3.3倍和2.3倍，慢生根瘤菌屬（Bradyrizobium）的豐度顯著高于健康煙株。

圖4 發(fā)病煙株和健康煙株根際土壤優(yōu)勢細菌屬比較Fig.4 Relative abundance of the most abundant genus in the rhizosphere soil

2.4 根際土壤細菌群落結構與土壤環(huán)境因子的關系

2.4.1 根際土壤化學性質

由表3可知，健康煙株根際土壤的pH值比發(fā)病煙株根際土壤高0.71個單位，且差異達到顯著水平。健康煙株根際土壤的有機質、有效磷、交換性鈣、交換性鎂、交換性鈉、有效銅和有效鋅含量有高于發(fā)病煙株的趨勢，其中有效磷、交換性鈣和有效銅3個指標顯著高于發(fā)病煙株。健康煙株根際土壤的堿解氮、速效鉀、有效鐵、有效錳和有效硼含量有低于發(fā)病煙株的趨勢，且速效鉀指標顯著低于發(fā)病煙株。

表3 發(fā)病煙株和健康煙株根際土壤的化學性質Tab.3 Chemical properties in disease infected plant and healthy plant rhizosphere soil

2.4.2 典范對應分析

為分析根際土壤細菌群落結構與土壤化學性質的關系，以細菌群落在門水平上的豐度數(shù)據(jù)作為物種數(shù)據(jù)，發(fā)病煙株和健康煙株根際土壤差異顯著的化學性質數(shù)據(jù)作為土壤環(huán)境變量，通過R語言的VEGAN數(shù)據(jù)包進行典范對應分析（CCA）（圖5）。前兩個排序軸總共解釋了64.55%的細菌群落變化，第一排序軸（CCA1）解釋了38.73%，第二排序軸（CCA2）解釋了25.82%，其中第一排序軸（CCA1）對土壤細菌群落變化解釋最多。發(fā)病煙株和健康煙株根際土壤彼此分離，健康煙株根際土壤樣品主要分布在縱坐標軸的左側，發(fā)病煙株根際土壤樣品主要分布在縱坐標軸的右側。土壤pH和交換性鈣（Ca）與橫坐標負軸夾角較小，表明這兩個指標與CCA1相關性較高；速效鉀（AK）與縱坐標正軸夾角較小，有效磷（AP）和有效銅（Cu）與縱坐標負軸夾角較小，表明這3個指標與CCA2相關性較高。同時，從圖中箭頭的分布可以看出，pH、AP、Ca和Cu這4個指標與健康煙株根際土壤細菌群落存在較強的正相關性。

圖5 根際土壤細菌群落結構與化學性質的CCA分析Fig.5 Canonical Correspondence Analysis of the relationship between rhizosphere soil bacterial community structure and chemical properities

2.4.3 根際土壤細菌群落與土壤環(huán)境因子的Spearman相關性分析

對發(fā)病煙株和健康煙株根際土壤多樣性指數(shù)和差異顯著屬豐度與土壤環(huán)境因子進行Spearman相關性分析發(fā)現(xiàn)（表4），在發(fā)病煙株根際土壤細菌群落中，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)與土壤Cu含量顯著正相關；Shannon指數(shù)與土壤AK和與Ca含量顯著負相關； Simpson指數(shù)與土壤AK和Ca含量顯著正相關；慢生根瘤菌屬（Bradyrizobium）的豐度與土壤pH顯著負相關，而與土壤AP含量顯著正相關；鞘脂菌屬（Sphingobium）的豐度與土壤pH顯著正相關，而與土壤AP含量顯著負相關；棲熱嗜油菌屬（Thermoleophilum）的豐度與土壤Cu含量顯著負相關。由此可知，發(fā)病煙株根際土壤細菌群落結構與土壤環(huán)境因子pH、AP、AK、Ca和Cu顯著相關。

在健康煙株根際土壤細菌群落中，Ace指數(shù)與土壤Ca含量顯著負相關；Chao指數(shù)與土壤Cu含量顯著正相關；Shannon指數(shù)與土壤AP含量顯著正相關，而與土壤AK含量顯著負相關；Simpson指數(shù)與土壤Ca含量顯著正相關；慢生根瘤菌屬（Bradyrizobium）的豐度與土壤AP含量顯著負相關，而與土壤AK含量顯著正相關；鞘脂菌屬（Sphingobium）的豐度與土壤Ca含量顯著正相關；棲熱嗜油菌屬（Thermoleophilum）的豐度與土壤Cu含量顯著負相關。由此可知，健康煙株根際土壤細菌群落結構與土壤環(huán)境因子AP、AK、Ca和Cu顯著相關。

表4 根際土壤細菌群落與土壤環(huán)境因子的Spearman相關性分析Tab.4 Spearman correlation analysis of rhizosphere soil bacterial community with soil environment factor

3 討論

（1）生態(tài)系統(tǒng)中物種多樣性指數(shù)反映了種群結構的復雜程度。一般來說，多樣性指數(shù)較高，系統(tǒng)的結構也較復雜，穩(wěn)定性相對較高[13]。本研究中用豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)分析根際土壤細菌Alpha多樣性，結果表明，健康煙株根際土壤細菌Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)有高于發(fā)病煙株的趨勢，這與前人的研究結果一致[14-15]，而Simpson指數(shù)有低于發(fā)病煙株的趨勢。說明健康煙株根際土壤細菌多樣性水平較高，群落結構優(yōu)于發(fā)病煙株。已有研究表明，土壤微生物多樣性對維持土壤健康和抑制植物病害非常重要，微生物多樣性的降低是土傳病害發(fā)生的重要原因。

（2）根據(jù)根際土壤細菌16S rDNA測序結果可以看出，發(fā)病煙株和健康煙株根際土壤之間的細菌門類和屬類組成基本相似，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）是根際土壤中的優(yōu)勢菌門，這與前人的研究結果一致[16-17]；Gaiella、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）是根際土壤中的優(yōu)勢菌屬。有多個細菌屬在發(fā)病煙株和健康煙株根際土壤之間存在顯著差異，棲熱嗜油菌屬 （Thermoleophilum）和鞘脂菌屬（Sphingobium）在健康煙株根際土壤中占據(jù)顯著優(yōu)勢，而慢生根瘤菌屬（Bradyrizobium）在發(fā)病煙株根際土壤中占據(jù)顯著優(yōu)勢。棲熱嗜油菌屬（Thermoleophilum）為高效嗜熱微生物，在油類的降解[18]方面有一定的作用；鞘脂菌屬（Sphingobium）對取代脲類除草劑[19-20]和有機氯農藥[21]具有優(yōu)良的降解能力，在除草劑和農藥污染土壤的修復中具有重要作用；慢生根瘤菌屬（Bradyrizobium）有固氮作用，能將分子N2轉化為NH3[22]，固氮微生物在氮素缺乏的土壤中更具競爭優(yōu)勢，土壤氮素含量的變化會影響固氮微生物與其它土壤微生物的競爭關系，從而影響固氮微生物的群落組成[23]；這三類細菌與青枯病的關系還有待更深一步的研究。根際微生物種群與植物的健康狀況也有著密切關系[24]。目前，已經(jīng)報道的用于防治青枯病的益生菌主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus）[25]、假單胞菌屬（Pseudomonas）[26]和鏈霉菌屬（Streptomyces）[27-28]等。在本研究中，芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和鏈霉菌屬（Streptomyces）等益生菌在健康煙株根際土壤中的豐度比其在發(fā)病煙株中分別高43.31%、1倍和56.47%；勞爾氏菌屬（Ralstonia）和Rudaea等病原菌在發(fā)病煙株根際土壤中的豐度是其在健康煙株中的2-3倍，煙草青枯病病原菌青枯雷爾氏菌就屬于勞爾氏菌屬。結果表明，由于青枯病的發(fā)生，根際土壤細菌群落中益生菌減少、病原菌增加，根際微生態(tài)細菌群落的功能受到破壞。

（3）土壤化學性質分析結果顯示，健康煙株根際土壤pH、AP、Ca和Cu含量顯著高于發(fā)病煙株，而AK含量顯著低于發(fā)病煙株。由此可見，發(fā)病煙株根際土壤pH較低，肥力狀況較差且營養(yǎng)元素，尤其是P、Ca、Cu元素缺失嚴重。土壤的微生態(tài)與土壤某些化學性質緊密相關。CCA分析結果表明，土壤pH、AP、AK、Ca和Cu對根際土壤細菌群落有較大的影響，且健康煙株根際土壤細菌群落與pH、AP、Ca和Cu存在較強的正相關性。Spearman相關性分析發(fā)現(xiàn)，土壤pH、AP、AK、Ca和Cu含量是影響發(fā)病煙株根際土壤細菌群落結構的關鍵土壤環(huán)境因子；土壤AP、AK、Ca和Cu含量是影響健康煙株根際土壤細菌群落結構的關鍵土壤環(huán)境因子。本研究從多種角度分析表明，土壤pH、AP、AK、Ca和Cu是影響青枯病發(fā)生的重要土壤環(huán)境因子。土壤酸化是導致青枯病發(fā)生的重要原因[29]，因此土壤調酸是控制青枯病發(fā)生的重要手段。P、K、Ca、Cu都是植物生長發(fā)育過程中必不可少的礦質營養(yǎng)元素，除了影響煙株正常的生長發(fā)育外，還能夠影響植物的抗病性。Wang等[30]的研究表明在健康土壤中的速效鉀含量顯著高于青枯病感染的土壤，而本研究的結果卻與之相反，出現(xiàn)這種情況的原因以及K元素與青枯病發(fā)生的關系還有待于進一步探討。已經(jīng)證明有多種植物病害與鈣素含量密切相關，Jiang[31]等研究指出，在一定范圍內，增加鈣濃度可以提高番茄植株的過氧化物酶活性，對番茄青枯病的控病效果也越好；He[32]等研究發(fā)現(xiàn)通過提高土壤中鈣離子濃度能夠延緩和降低煙草青枯病發(fā)生。銅素是植物體內多種蛋白質和酶的組成成分，直接參與酚類代謝，提高植物抗病力，李鑫[33]等的研究表明銅元素具有誘導抗病性、增強煙草對PVYN侵染的抵抗能力。根際土壤細菌群落與土壤環(huán)境因子互作影響青枯病的發(fā)生，這種互作關系和作用機制值得進一步深入研究，進而為有效防控青枯病提供新的線索。

4 結論

健康煙株根際土壤表現(xiàn)出更高的細菌多樣性，群落結構優(yōu)于發(fā)病煙株根際土壤；發(fā)病煙株根際土壤中芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和鏈霉菌屬（Streptomyces）等益生菌減少，而勞爾氏菌屬（Ralstonia）和Rudaea等病原菌增加；發(fā)病煙株根際土壤pH較低，肥力狀況較差且營養(yǎng)元素，尤其是P、Ca、Cu元素缺失嚴重；土壤 pH、AP、AK、Ca和Cu是影響發(fā)病煙株根際土壤細菌群落結構的重要土壤環(huán)境因子。