張丹妮　劉艷軍　李建科　蒲思宜　汪永慶　黃俊軒　楊靜慧　武春霞

摘 要：為了建立松散型愈傷組織再生體系，試驗采用馬鈴薯莖段為外植體，在含有不同激素的培養(yǎng)基上誘導出愈傷組織，再將誘導出的愈傷組織轉接到含有不同激素的培養(yǎng)基上進行松散型愈傷組織的誘導，將誘導出的松散型愈傷組織轉接到再生培養(yǎng)基上進行再生芽的誘導，從中篩選出再生效果最好的培養(yǎng)基配方。結果表明，在MS+2 mg·L-1 2，4-D的培養(yǎng)基上獲得的愈傷組織生長效果最好；在MS+1 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 2，4-D的培養(yǎng)基上可以獲得理想的松散型愈傷組織，馬鈴薯松散型愈傷組織在MS+0.5 mg·L-1 KT培養(yǎng)基上誘導后可以獲得較高的再生率。

關鍵詞：馬鈴薯；愈傷組織；培養(yǎng)基；再生

中圖分類號：S532 文獻標志碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.08.017

Abstract： To establish a regeneration system of potato loose callus， the stem segments were used as explants to induce callus on medium containing different hormones. The induced callus was then transferred onto the medium containing different hormones to induce the loose callus. The induced loose callus was transferred to the regeneration medium for regeneration bud induction， and the best regeneration medium was screened out. The results showed that the callus induced by MS+2 mg·L-1 2，4-D medium had the best growth， the ideal loose callus was obtained from MS+1 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 2，4-D medium， and the high regeneration rate was obtained when the potato loose callus was cultured on MS+0.5 mg·L-1 KT medium.

Key words：potato； callus； medium； regeneration

愈傷組織是一種特殊的細胞，是植物在傷口部位形成的一種起到保護作用的薄壁細胞，因為愈傷組織體系穩(wěn)定，細胞之間差異較少，很容易獲得均一的細胞環(huán)境，可以進行遺傳、生理生化等相關研究[1]。有關愈傷組織的研究報道很多，多集中于誘導愈傷組織和愈傷組織離體再生的研究等方面[2-7]。

馬鈴薯是重要的糧食作物，關于馬鈴薯愈傷組織研究的報道很多。馬鈴薯愈傷組織具有多種用途：一是通過愈傷組織離體誘變技術進行種質(zhì)資源創(chuàng)新研究[8-11]，獲得優(yōu)良的種質(zhì)資源，為馬鈴薯的育種提供優(yōu)良性狀；二是通過愈傷組織快速培養(yǎng)技術，可以脫除組織中的一些通過維管組織傳播的病毒[12-16]，從而建立快速、高效的馬鈴薯脫毒體系；三是建立馬鈴薯組培快繁體系，為生產(chǎn)上提供大量的優(yōu)質(zhì)種苗；四是可以通過馬鈴薯愈傷組織體系進行相關的科學研究。目前，有關馬鈴薯愈傷組織的研究多集中在質(zhì)地緊密型愈傷組織的誘導及再生，這種愈傷組織在誘變育種、脫毒和快繁等方面效率較低，這就需要建立新型的馬鈴薯愈傷組織再生體系。

本研究通過誘導出馬鈴薯松散型愈傷組織，再誘導愈傷組織再生，建立馬鈴薯松散型愈傷組織離體再生體系，旨在提高愈傷組織在各種應用中的效率，為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試植物材料馬鈴薯組培苗由天津農(nóng)學院園林植物實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬鈴薯愈傷組織初步誘導培養(yǎng)基的篩選 在超凈臺中剪取馬鈴薯組培苗莖段，每個莖段不帶腋芽，只取2個葉片之間的部分。將剪好的馬鈴薯莖段外植體接種到事先配制好的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。愈傷組織初步誘導培養(yǎng)基采用MS為基本培養(yǎng)基，附加0.5，1.0，2.0，3.0 mg·L-1 2，4-D，另外附加30 g·L-1的蔗糖和7 g·L-1的瓊脂粉，pH值調(diào)節(jié)到5.8，置于組培室中進行愈傷組織的誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，24 h連續(xù)光照，光照強度1 000 lx。接種后每天觀察莖段外植體傷口部位的變化，30 d時統(tǒng)計每個處理愈傷組織誘導情況。

1.2.2 馬鈴薯松散型愈傷組織誘導培養(yǎng)基的篩選 將1.2.1中誘導出的愈傷組織從外植體上切下，分割成大小3 mm的小塊，將切分好的愈傷組織塊接種到事先配制好的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基的配制與1.2.1相同，是MS基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的BA、KT和2，4-D，置于組培室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件也與1.2.1相同。

1.2.3馬鈴薯愈傷組織再生體系的建立 將1.2.2誘導出的馬鈴薯松散型愈傷組織在超凈臺中分割成直徑為3 mm的小塊，分割時注意不要使愈傷組織分散開。不同再生培養(yǎng)基的配制過程與1.2.2相同。將愈傷組織接種到事先配制好的再生培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件與1.2.2相同，只是光照強度提高到2 000 lx。接種后觀察愈傷組織的變化，40 d后統(tǒng)計每個處理愈傷組織再生的情況。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯愈傷組織初步誘導培養(yǎng)基的篩選

從表1可以看出，在2，4-D濃度為0.5 mg·L-1時，所有外植體均沒有獲得愈傷組織，只是在傷口部位長出一些不定根，這是由2，4-D的使用濃度不夠、外植體內(nèi)源生長素較高造成的；在2，4-D濃度為1.0 mg·L-1時，可以誘導出少量愈傷組織，但愈傷組織生長速度較慢；當2，4-D濃度為2.0 mg·L-1時，愈傷組織誘導率明顯增加，愈傷組織的生長速度較快，誘導出的愈傷組織為白色、質(zhì)地較硬的愈傷組織類型；當2，4-D濃度達到3.0 mg·L-1時，愈傷組織誘導率降低、生長速度減慢，且質(zhì)地變軟，甚至在培養(yǎng)后期出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，說明2，4-D的使用濃度過高，對愈傷組織造成了毒害作用。由此可見，在MS培養(yǎng)基中添加2.0 mg·L-1 2，4-D進行初步誘導，可以獲得較理想的愈傷組織。

2.2 馬鈴薯松散型愈傷組織的誘導培養(yǎng)基篩選

從表2可以看出，與BA+2，4-D組合相比較，KT+2，4-D組合的各處理均可使愈傷組織生長速度加快，說明KT較BA更適合馬鈴薯愈傷組織的誘導。采用BA與2，4-D配合使用時，其比值不同，對愈傷組織生長及形態(tài)影響不同，在比值較低（0.5和1.0）時，愈傷組織為緊密型，質(zhì)地較軟，說明2，4-D的作用較大，愈傷組織細胞生長迅速，多由巨大型的大液泡細胞組成；當比值增大至2.0時，愈傷組織質(zhì)地變硬，結構變得松散，但也從透明、半透明狀變成褐色，說明BA對愈傷組織產(chǎn)生了毒害作用。采用KT與2，4-D配合使用時，各處理愈傷組織均可快速生長，且隨著KT與2，4-D比值的增加，愈傷組織質(zhì)地逐漸變硬，結構變得松散。由此可見，根據(jù)愈傷組織生長情況，理想的松散型馬鈴薯愈傷組織誘導培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 2，4-D。

2.3 馬鈴薯再生體系建立

從表3可以看出，培養(yǎng)基中不添加激素，愈傷組織也能夠再生，雖然再生率較低，但生長正常，說明此時的松散型愈傷組織基本處于胚性化，可以在沒有激素的培養(yǎng)基上再生出芽，但由于內(nèi)源生長素水平較高，再生芽生長受到抑制，可在培養(yǎng)基中添加一定量的分裂素，對生長素起到一定的中和作用，以促進再生芽的生長。在培養(yǎng)基中加入0.5 mg·L-1 2，4-D的基礎上，加入1.0或2.0 mg·L-1 KT，均無任何愈傷組織再生出芽，說明2，4-D對愈傷組織再生有一定的抑制作用。在培養(yǎng)基中加入0.5或1.0 mg·L-1 KT，可以獲得較高的愈傷組織再生率，其中0.5 mg·L-1 KT可獲得最高再生率且生長正常，而1.0 mg·L-1 KT再生率下降、生長緩慢且長勢弱，說明KT濃度高亦會抑制再生。由此可見，選擇MS+0.5 mg·L-1 KT培養(yǎng)基可以獲得理想的再生效果。

3 結論與討論

愈傷組織形態(tài)可以通過激素來調(diào)節(jié)，有研究認為，激素改變了愈傷組織中各種細胞的組成比例，從而導致愈傷組織的整體性質(zhì)發(fā)生變化，最終產(chǎn)生不同類型的愈傷組織[17-22]。一般來說，愈傷組織是由薄壁細胞構成，主要有2種，一為分裂能力強、細胞質(zhì)濃、個體小的細胞，其數(shù)量增加可使愈傷組織質(zhì)地變硬；二為巨大型的大液泡細胞，這類細胞組成的愈傷組織質(zhì)地軟，不利于再生誘導[23]。愈傷組織結構主要取決于以上2種愈傷組織細胞的比例，適當?shù)幕旌?種細胞可以使得愈傷組織結構松散，相反，增加巨大型的大液泡細胞愈傷組織變軟，最后解體死亡，而增加分裂旺盛的小細胞數(shù)量就會使得細胞連接緊密，形成緊密型愈傷組織，因此適當調(diào)節(jié)二者的比例使之分布均勻，才能控制愈傷組織結構，使之變得松散。除了通過激素的調(diào)節(jié)影響愈傷組織類型，還可以通過改變培養(yǎng)條件或在繼代培養(yǎng)有目的取舍，對愈傷組織形態(tài)與類型的誘導產(chǎn)生重要影響。

在本研究中，首先采用2，4-D進行馬鈴薯愈傷組織的誘導，通過改變2，4-D的濃度可以誘導出一定的愈傷組織，然后通過調(diào)整培養(yǎng)基中的分裂素與2，4-D之間的比例，可以改變愈傷組織的類型。通過試驗結果的優(yōu)化，建立了高效馬鈴薯松散型愈傷組織再生體系，具體步驟如下：采用馬鈴薯莖段為外植體，在MS+2 mg·L-1 2，4-D的培養(yǎng)基上誘導出愈傷組織；將誘導出的愈傷組織轉接到MS+1 mg·L-1KT+0.5 mg·L-1 2，4-D的培養(yǎng)基上進行松散型愈傷組織的誘導；將誘導出的松散型愈傷組織轉接到MS+0.5 mg·L-1 KT再生培養(yǎng)基上進行再生芽的誘導，整個過程需要40 d即可誘導出馬鈴薯再生芽。

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