外用中藥制劑治療濕疹的動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展

余志杰，劉玉杰，王 平，李勁松，徐 穎，孫 濤

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137；2. 廣元市第一人民醫(yī)院康復(fù)科，四川 廣元 628017)

濕疹是由多種內(nèi)外因素相互作用引起的表皮及真皮淺層的炎癥性皮膚病，臨床主要表現(xiàn)為瘙癢、丘皰疹、糜爛、結(jié)痂、紅斑、苔蘚化等[1]。根據(jù)皮膚損害的嚴(yán)重程度，濕疹分為急性、亞急性和慢性濕疹。其臨床特征表現(xiàn)為多形性、對(duì)稱性、復(fù)發(fā)性，且病因復(fù)雜，病情易反復(fù)，嚴(yán)重影響了人們的健康生活[2]。中醫(yī)稱濕疹為浸淫瘡、濕瘡等，主要與先天稟賦不耐、外邪侵襲有關(guān)，以外感風(fēng)、濕、熱邪為標(biāo)，臟腑功能失調(diào)為本[3]。故中醫(yī)采用祛風(fēng)燥濕、清熱解毒、化腐生肌的治法外治濕疹，其劑型常為膏劑、洗劑、散劑[4]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，濕疹的病因與遺傳因素、血液循環(huán)障礙、精神因素、環(huán)境因素(空氣、花粉等)、飲食及細(xì)菌感染相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與免疫系統(tǒng)中各種細(xì)胞因子水平密切相關(guān)[5]。濕疹屬于變態(tài)反應(yīng)性疾病，主要與Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)、Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)有關(guān)，也與瘙癢反應(yīng)、炎癥、真菌感染密切相關(guān)?；诖?，本文分析并總結(jié)了外用中藥制劑治療濕疹的動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法，從主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)(抗過(guò)敏、止癢)、輔佐藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)(抗炎、抑菌)兩個(gè)角度，綜述外用中藥制劑治療濕疹的動(dòng)物模型及機(jī)制評(píng)價(jià)方法，在現(xiàn)有的模型基礎(chǔ)上，改良其造模方法，總結(jié)并分析藥效及機(jī)制的觀察指標(biāo)，從而為治療濕疹的外用中藥制劑的開(kāi)發(fā)提供思路和借鑒。

1 抗過(guò)敏實(shí)驗(yàn)

1.1抗過(guò)敏動(dòng)物模型建立及宏觀指標(biāo)評(píng)價(jià)抗過(guò)敏實(shí)驗(yàn)主要?jiǎng)游锬Ｐ蜑?,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)/2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)誘發(fā)動(dòng)物炎癥，從而建立慢性濕疹模型，動(dòng)物大多選擇小鼠、大鼠，其模型癥狀主要為紅斑、苔蘚化、結(jié)痂等，造模評(píng)價(jià)方法多采用外觀癥狀觀察、組織病理切片及炎癥因子IL-4、IFN-γ指標(biāo)。DNCB誘導(dǎo)小鼠耳組織慢性濕疹模型表現(xiàn)為耳表皮增厚、充血、血管擴(kuò)張等癥狀，并通過(guò)耳組織病理評(píng)分及HE染色，觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，綜合評(píng)價(jià)模型成功與否，以耳腫脹度及炎癥因子作為藥效機(jī)制評(píng)價(jià)指標(biāo)。具體造模方法見(jiàn)Tab 1。

由此可見(jiàn)，慢性濕疹動(dòng)物模型主要采用高濃度的DNCB溶液，涂于動(dòng)物腹部/背部致敏，再以低濃度的DNCB溶液反復(fù)耳部激發(fā)，模擬臨床皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫、結(jié)痂、邊界不清、滲出傾向等癥狀，加以病理組織切片微觀觀察，共同確定模型建成與否。國(guó)內(nèi)學(xué)者也有采用SD大鼠制備濕疹動(dòng)物模型，筆者認(rèn)為大鼠實(shí)驗(yàn)操作方便，背部皮損癥狀易于辨別，腫脹程度較為明顯，且同耳部皮膚相比，與人類皮膚結(jié)構(gòu)更為接近，因此，大鼠也可作為理想的動(dòng)物模型。而小鼠作為經(jīng)典的慢性皮炎濕疹模型動(dòng)物，被廣大研究者所認(rèn)同，同時(shí)，利用豚鼠建立該模型也有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道。但部分文獻(xiàn)采用動(dòng)物性別為♀♂各半，♀動(dòng)物自身分泌的雌激素具有一定的抗炎作用，故宜采用♂動(dòng)物建立濕疹模型，以確保實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的嚴(yán)謹(jǐn)性。

1.2抗過(guò)敏機(jī)制有學(xué)者認(rèn)為，Th1/Th2細(xì)胞分泌失衡是導(dǎo)致濕疹發(fā)病機(jī)制之一。研究表明，Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)應(yīng)答分泌的IL-4與濕疹的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，濕疹模型組大鼠耳組織的INF-γ含量比空白組明顯增加[7]。此外，IL-31可以不依賴肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，引起臨床濕疹的組織特征[13]。研究報(bào)道，表皮中絲聚合蛋白的缺陷，在濕疹發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[14]。同時(shí)，濕疹的發(fā)生是以炎癥為基礎(chǔ)，如Tab 1所示，濕疹機(jī)制的研究，除測(cè)量外周血中IL-1β、IL-4、IL-17、LTB4、INF-γ、TNF-α等，也應(yīng)重視對(duì)皮膚部位相關(guān)細(xì)胞因子的研究。

2 止癢實(shí)驗(yàn)

2.1止癢動(dòng)物模型的建立及宏觀指標(biāo)評(píng)價(jià)濕疹癥狀中的瘙癢是發(fā)生在炎性皮損的皮膚上，因此屬于炎癥性皮膚瘙癢[15]。鑒于此，目前主要采用化學(xué)物質(zhì)作用于動(dòng)物皮膚上，引發(fā)動(dòng)物瘙抓行為，觀察動(dòng)物的瘙抓潛伏時(shí)間、瘙抓次數(shù)、瘙癢介質(zhì)和炎性細(xì)胞因子(Tab 2)。

由Tab 2可知，瘙癢動(dòng)物模型主要用豚鼠、小鼠。豚鼠雖對(duì)外界刺激較為敏感，但成本較高，而小鼠瘙癢模型穩(wěn)定性和重復(fù)性欠佳，其瘙抓反應(yīng)不易觀察。因此，尚需尋求一種價(jià)格合適，對(duì)瘙癢較為敏感的動(dòng)物，如NC/Nga小鼠在屋塵螨的普通環(huán)境會(huì)出現(xiàn)與人類相似的瘙抓反應(yīng)[16]。同時(shí)，不同動(dòng)物其瘙癢行為的觀察時(shí)間也不相同，這與選擇的動(dòng)物對(duì)瘙癢介質(zhì)的敏感程度有關(guān)。且不同的瘙癢介質(zhì)導(dǎo)致的瘙癢機(jī)制并不相同，如氯喹引起的瘙癢不屬于過(guò)敏性疾病，因此，氯喹致癢模型不適用于濕疹引起的瘙癢研究。目前，瘙癢模型大多以單一致癢因素造模，與臨床多因素引發(fā)的瘙癢機(jī)制區(qū)別較大，因此，采用多種方式建立的復(fù)雜性瘙癢動(dòng)物模型與臨床瘙癢發(fā)病機(jī)制更為相近，如組胺(0.03%)與4-氨基吡啶(0.07%)聯(lián)用，可明顯增加豚鼠瘙抓次數(shù)[19]。

2.2止癢機(jī)制目前瘙癢的發(fā)病機(jī)制研究較多，但其具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不清楚。瘙癢介質(zhì)作用于感覺(jué)神經(jīng)元，傳遞瘙癢的信號(hào)。此外，肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺也可引起瘙抓反應(yīng)，但并不是所有的瘙癢都符合此機(jī)制。因此，應(yīng)結(jié)合具體的病情，合理選擇致癢因子作為機(jī)制觀察指標(biāo)。如采用DNCB誘發(fā)小鼠濕疹建立瘙癢模型，通過(guò)觀察瘙抓次數(shù)、P物質(zhì)、IL-31、組胺等瘙癢介質(zhì)，研究濕疹與瘙癢的內(nèi)在關(guān)系。此外，Oetjen等[20]研究顯示，IL-4可直接激活小鼠感覺(jué)神經(jīng)元，并進(jìn)一步證實(shí)，慢性瘙癢依賴于神經(jīng)元IL-4Rα和JAK1信號(hào)通路。

3 輔助藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

濕疹的炎癥發(fā)生在皮膚表層，臨床表現(xiàn)為紅斑、丘疹的癥狀。國(guó)內(nèi)學(xué)者采用二甲苯[6-7]、角叉菜膠[7]分別建立急性、亞急性炎癥模型，以腫脹度及病理切片為指標(biāo)，研究藥物對(duì)濕疹的抗炎作用。抗炎機(jī)制與IL-1β、IL-4、IL-6等炎癥因子緊密相關(guān)。Lee等[21]采用Western blot技術(shù)，測(cè)定核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、磷酸化IκBα、MAPKs的表達(dá)，評(píng)估當(dāng)歸抗皮膚炎癥的作用機(jī)制。另外，濕疹的發(fā)生與真菌感染密切相關(guān)。因此，也可以臨床濕疹患者分離的菌種為研究對(duì)象，收集并總結(jié)分析引起濕疹的菌種特點(diǎn)，運(yùn)用微生物學(xué)的研究方法與技術(shù)，深入探究濕疹的病因與微生物感染的內(nèi)在關(guān)系。

Tab 1 Establishment of eczema animal models and evaluation indicators

Tab 2 Establishment of pruritus animal models and evaluation indicators

4 小結(jié)

綜上，濕疹的臨床癥狀復(fù)雜且多變，主要表現(xiàn)為炎癥、瘙癢、滲出等，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，評(píng)價(jià)治療濕疹的外用制劑藥效及機(jī)制研究尚需加強(qiáng)。首先，應(yīng)圍繞濕疹發(fā)病特征為核心，構(gòu)建并采用與臨床癥狀相符的多因素導(dǎo)致的濕疹動(dòng)物模型，多角度、多層次全面評(píng)價(jià)外用中藥制劑治療濕疹的藥效。主要探究外用制劑抗DNCB所致慢性濕疹、止癢的主要藥效學(xué)研究；同時(shí)，觀察藥物對(duì)急性、亞急性炎癥的抗炎作用，也可加強(qiáng)藥物對(duì)引發(fā)濕疹各種真菌的抑菌效果研究，從抗炎、抑菌的角度，輔助評(píng)估外用中藥制劑防治濕疹的藥效。此外，充分利用特定種系和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)，如NC/Nga小鼠和高表達(dá)的IL-4轉(zhuǎn)基因小鼠[16,22]。其次，可考慮新型細(xì)胞模型的應(yīng)用。濕疹細(xì)胞模型建立主要采用人類肥大細(xì)胞HMC-1[23]、角質(zhì)細(xì)胞HaCaT[10]、大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞RBL-2H3[24]等，體外模型抗過(guò)敏機(jī)制的研究應(yīng)結(jié)合瘙癢機(jī)制的最新研究進(jìn)展，選擇兩者共同的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，深入探究濕疹與瘙癢的相互聯(lián)系。同時(shí)，也應(yīng)重視符合臨床濕疹體外多細(xì)胞融合模型的建立，如劉學(xué)偉[25]研究發(fā)現(xiàn)，濕疹患者淋巴細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞以3 ∶1的比例接種，可建立慢性濕疹體外細(xì)胞模型，提示有望用于評(píng)價(jià)濕疹藥效的體外細(xì)胞模型。王南南等[24]采用基因工程技術(shù)，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)hFcεRIα的RBL-2H3細(xì)胞，為深入研究變態(tài)反應(yīng)發(fā)病機(jī)制提供了條件。