葉芳杏，何俊慧，李梅蘭，黃仁彬，謝佳秀，黃建春

( 廣西醫(yī)科大學藥學院，廣西 南寧 530021)

高血壓、冠心病、心肌梗死等多種心血管疾病是導致慢性心衰最常見、最重要的高危因素之一，其發(fā)病人數(shù)及發(fā)病率逐年上升[1]。各種病理性因素刺激引發(fā)的心室重構(gòu)是導致心衰的內(nèi)在原因。研究發(fā)現(xiàn)，若能去除這些因素的刺激，心室重構(gòu)是一個可逆的病理生理過程[2]。玉郎傘(又稱龍眼參)系蝶形花科植物疏葉崖豆Millettiapulchra(Benth.) Kurz var. Laxior (Dunn) Z.Wei 的塊根，已被收錄于地方民族藥志《廣西自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準(2008年版)》。為了進一步明確玉郎傘治療心血管疾病的藥效學基礎，我們對玉郎傘進行了一系列化學成分提取、分離，獲得了多個單體[3]。其中，藥效篩選實驗表明，17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮(17-methoxyl-7-hydroxy-benzene-furanchalcone, MHBFC)活性較強。前期研究發(fā)現(xiàn)，MHBFC能明顯恢復內(nèi)皮細胞的分泌功能，提高心肌組織內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)活性，增加NO釋放，能明顯逆轉(zhuǎn)大鼠壓力超負荷誘導的心血管重構(gòu)[4]。而eNOS活性是如何被調(diào)控的，其機制尚未清楚。因此，本研究在前期工作基礎上，復制大鼠壓力超負荷心室重構(gòu)模型，造模給藥后，分離提取心肌微血管內(nèi)皮細胞(myocardial microvascular endothelial cell, MMVEC)，探討MHBFC預處理對壓力超負荷心室重構(gòu)大鼠MMVEC eNOS-NO信號通路相關基因和蛋白表達的影響，以期了解MHBFC預處理逆轉(zhuǎn)壓力超負荷心室重構(gòu)大鼠的調(diào)控機制，進一步明確MHBFC的作用靶點，對于有效控制壓力超負荷心室重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展具有重要的理論意義。

1 材料

1.1實驗動物SPF級SD大鼠，♂，體質(zhì)量(140±20)g，廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)及使用許可證號分別為SCXK桂2014-0002、SYXK桂2014-0003。

1.2藥物與試劑玉郎傘采自廣西靈山，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為蝶形花科植物疏葉崖豆的塊根；玉郎傘黃酮單體MHBFC，由廣西醫(yī)科大學藥學院提取分離，經(jīng)HPLC檢測純度為95%；亞硝基左旋精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride,L-NAME)(Sigma，批號BCBF4375V)；戊巴比妥鈉(Merck，批號P11011)；Ⅱ型膠原酶(Gibco，批號1212804)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，批號1830857)；內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium, ECM)(ScienCell，批號21959)；Dil-乙酰低密度脂蛋白(Dil-acetylated low-density lipoprotein, Dil-Ac-LDL)(Solarbio，批號20170414)；增強型RIPA裂解液(博士德生物工程有限公司，批號11K18B02)；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒(Beyotime Biotechnology，批號060216160810)；兔抗鼠eNOS、p-eNOS、Akt、p-Akt單克隆抗體、紅外熒光染料標記的羊抗兔IgG二抗(美國CST公司)；兔抗鼠PI3K p85、p-PI3K p85 Tyr607單克隆抗體(OriGene Technologies公司)；PCR引物及試劑盒(TaKaRa公司)。

1.3儀器BB-150細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)；CKX-41熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；ABI7300實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

2 方法

2.1動物造模、分組及給藥按照文獻[4]縮窄大鼠腹主動脈，誘導心室重構(gòu)模型。假手術組大鼠只游離腹主動脈，不縮窄。術后d 4，將存活大鼠隨機分為 6組，每組5只：① 假手術組；② 模型組；③ MHBFC 6 mg·kg-1組；④ MHBFC 12 mg·kg-1組；⑤ MHBFC 12 mg·kg-1+L-NAME 50 mg·kg-1組；⑥L-NAME 50 mg·kg-1組。分組后灌胃給予相應藥物，各組藥物用蒸餾水溶解配制成相應濃度，連續(xù)給藥42 d，每天灌胃1次。

2.2MMVEC分離培養(yǎng)及鑒定參照文獻[5]酶消化法并加以適當改進。麻醉大鼠后，75%酒精消毒2 min，取心臟，Hanks液洗3遍，剪取左心室，75%酒精滅活心內(nèi)外膜組織15 s，將心肌組織剪成約1 mm3大小的組織塊，把組織塊夾到15 mL離心管，分別滴加0.2%Ⅱ型膠原酶5 mL和0.25%胰蛋白酶6 mL，各消化10 min，消化結(jié)束后，滴加內(nèi)含5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細胞生長因子和1%青霉素/鏈霉素的ECM終止消化，200目金屬篩網(wǎng)過濾，1 200 r·min-1離心8 min，棄上清，用2 mL ECM反復吹打，直到混成單細胞懸液，將細胞懸液接種到培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶再加入2 mL ECM，輕輕搖晃，使細胞分散，放到37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，倒出培養(yǎng)液，滴加ECM繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3 d換液1次，并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。采用Dil-Ac-LDL吞噬實驗鑒定MMVEC，鑒定方法參照文獻[6]。

2.3qPCR檢測MMVECeNOS、PI3K、Akt基因表達目的基因eNOS、PI3K、Akt及內(nèi)參GAPDH引物序列見Tab 1。用Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR system 進行PCR擴增。采用公式2-ΔΔCt計算MMVEC各基因相對表達量。

Tab 1 Primer sequences of qPCR

2.4Westernblot檢測MMVECeNOS、p-eNOS、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表達當細胞長滿90%時，倒掉細胞培養(yǎng)基，每瓶MMVEC中加入500 μL配好的混合液(每1 mL冷的蛋白裂解液加入10 μL增強型RIPA裂解液和10 μL磷酸酶抑制劑)，裂解，提取MMVEC蛋白，蛋白定量后煮沸，SDS-PAGE恒壓電泳分離蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)印蛋白于PVDF膜，封閉液搖床1 h，將膜分別放入裝有相應比例稀釋的一抗中，4 ℃孵育14～24 h，洗膜后，將膜放入二抗稀釋液稀釋的紅外熒光染料標記的羊抗兔IgG二抗中(1 ∶15 000)，搖床上室溫避光孵育1 h。采用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜，保存圖片。用Odyssey掃膜軟件分析各條帶的灰度值，結(jié)果以目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值比值來表示該蛋白的表達水平。

3 結(jié)果

3.1MMVEC的形態(tài)學觀察取部分原代培養(yǎng)d 3的細胞在倒置顯微鏡下觀察可見，細胞大部分已貼壁，體積較小，多數(shù)呈短梭狀，少數(shù)呈多角形或三角形，散在單層排列(Fig 1A)。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細胞生長迅速，大部分細胞已完全伸展開，體積變大，呈梭形、三角形或多角形。培養(yǎng)至d 5，貼壁細胞較多，幾乎長滿瓶底，呈現(xiàn)典型內(nèi)皮細胞的鋪路石樣結(jié)構(gòu)(Fig 1B)。

3.2MMVEC鑒定取培養(yǎng)至d 5的原代細胞，采用Dil-Ac-LDL吞噬實驗鑒定。細胞經(jīng)Dil-Ac-LDL染色后，于熒光倒置顯微鏡下觀察，細胞呈現(xiàn)紅色熒光，其陽性表達率> 95%(Fig 2)，說明該細胞為MMVEC。陰性對照細胞不能觀察到熒光。

Fig 1 MMVEC morphology(×200) A: Cultured for 3 d; B: Cultured for 5 d.

Fig 2 Dil-Ac-LDL dyed picture of MMVEC (×200)

3.3MHBFC對壓力超負荷心室重構(gòu)大鼠MMVECeNOS、PI3K、Akt基因表達水平的影響如Tab 2所示，縮窄腹主動脈6周后，模型組和L-NAME組大鼠MMVEC eNOS、PI3K、Akt mRNA表達均明顯下調(diào)(P<0.05)；L-NAME組大鼠MMVEC eNOS mRNA表達比模型組下調(diào)更明顯(P<0.05)，但合用MHBFC后，被抑制的eNOS、PI3K、Akt mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.05)；另外，MHBFC預處理組eNOS、PI3K、Akt mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.05)。

Tab 2 Effect of MHBFC on expression of eNOS, PI3K and Akt genes in MMVEC of rats with pressure overload-induced ventricular remodeling n=5)

#P<0.05vssham-operated;*P<0.05vsmodel;△P<0.05vsL-NAME 50 mg·kg-1

3.4MHBFC對壓力超負荷心室重構(gòu)大鼠MMVECp-eNOS、p-PI3K、p-Akt蛋白表達的影響如Fig 3、Tab 3所示，縮窄腹主動脈6周后，模型組和L-NAME組大鼠MMVEC p-eNOS、p-PI3K和p-Akt 蛋白表達均明顯下調(diào)(P<0.05)，總eNOS、PI3K和Akt蛋白表達水平也下調(diào)，但各組間總的eNOS、PI3K和Akt蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義。合用MHBFC后，被抑制的MMVEC p-eNOS、p-PI3K和p-Akt蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)；另外，MHBFC預處理組MMVEC p-eNOS、p-PI3K和p-Akt蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05)。

Fig 3 Representative Western blot bands of p-eNOS, eNOS, p-Akt, Akt, p-PI3K, PI3K and GAPDH

1: Sham-operated group; 2: Model group; 3: MHBFC 6 mg·kg-1group; 4: MHBFC 12 mg·kg-1group; 5: MHBFC 12 mg·kg-1+L-NAME 50 mg·kg-1group; 6:L-NAME 50 mg·kg-1group.

Tab 3 Effect of MHBFC on expression of p-eNOS, p-PI3K and p-Akt proteins in MMVEC of rats with pressure overload-induced ventricular n=5)

#P<0.05vssham-operated;*P<0.05vsmodel;△P<0.05vsL-NAME 50 mg·kg-1

4 討論

通過縮窄腹主動脈誘導心室重構(gòu)模型是目前常用的一種方法?？s窄大鼠的腹主動脈會導致后負荷迅速增加，在短時間內(nèi)很容易導致心肌肥厚，一般造模4周就可出現(xiàn)心血管重構(gòu)的主要病理生理性改變[7]。內(nèi)皮功能障礙會導致血管舒縮功能障礙、內(nèi)皮通透性增加、血小板黏附聚集、細胞因子產(chǎn)生等，促進心室重構(gòu)向心衰發(fā)展。尤其是血管內(nèi)皮細胞的損傷會導致高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等血管損傷性疾病。由eNOS合成的NO能調(diào)節(jié)血管張力，抑制血小板黏附與聚集，改善血管內(nèi)皮舒張功能，改善血流剪切應力，保護內(nèi)皮細胞[8]。

研究表明，內(nèi)皮細胞的分泌功能是非常強大的，其中MMVEC不僅可以調(diào)節(jié)血管的舒縮功能、血管壁的通透性、細胞生長和增殖等，而且還能釋放一些生物活性物質(zhì)，如NO、前列環(huán)素、血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素-1等，調(diào)節(jié)心肌組織功能[9]。本實驗選擇MMVEC作為研究對象，大鼠造模給藥結(jié)束后，采用酶化學消化法分離培養(yǎng)大鼠原代MMVEC，分離獲得的MMVEC表現(xiàn)典型的鋪路石樣結(jié)構(gòu)，而且通過采用比較公認的Dil-Ac-LDL吞噬實驗鑒定，證實該細胞為MMVEC。該分離培養(yǎng)方法獲得的MMVEC純度高，數(shù)量多，生長狀態(tài)良好且長得快，是目前分離培養(yǎng)原代MMVEC較成熟的一種方法。前期研究發(fā)現(xiàn)MHBFC能改善MMVEC的分泌功能，增加NO合成和釋放，抑制MMVEC凋亡，發(fā)揮抗心肌肥大作用，逆轉(zhuǎn)大鼠壓力超負荷心室重構(gòu)。

eNOS-NO信號通路介導MMVEC中的eNOS催化產(chǎn)生保護性的NO，在壓力超負荷心室重構(gòu)中主要表現(xiàn)為抗心肌肥大作用。L-NAME是NOS抑制劑，其能抑制NOS活性，減少NO生成，不僅可以升高血壓，而且還會促進左心室重構(gòu)發(fā)生和發(fā)展[10]。單獨給予NOS阻斷劑L-NAME 6周后，MMVEC p-eNOS蛋白表達比模型組明顯降低，但合用MHBFC組MMVEC p-eNOS蛋白表達水平比模型組上調(diào)，且eNOS蛋白磷酸化表達水平明顯高于L-NAME組。提示MHBFC能提高eNOS酶活性，增加NO含量，且該調(diào)控機制可能與MHBFC能明顯增加eNOS蛋白磷酸化水平有關。

eNOS可在多個絲∕蘇氨酸位點上發(fā)生磷酸化或去磷酸化反應，從而調(diào)節(jié)eNOS酶活性及NO的產(chǎn)量。研究已經(jīng)證實，提高eNOS活性，增加p-eNOS的表達量具有明顯的降壓和抗心肌肥大作用[11]。另外，PI3K和Akt是eNOS-NO信號通路上游的重要調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)心肌細胞生長、心肌肥大和心力衰竭的發(fā)展進程中起著重要作用[12]。激活PI3K/Akt信號通路，能上調(diào)p-Akt的表達，降低細胞凋亡，改善心肌肥大，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，MHBFC預處理組MMVEC eNOS、PI3K和Akt蛋白磷酸化水平比模型組均明顯上調(diào)，且MMVEC eNOS、PI3K、Akt mRNA表達也明顯上調(diào)，但L-NAME組MMVEC eNOS蛋白磷酸化水平及eNOS mRNA相對表達水平比模型組明顯降低，而合用MHBFC組MMVEC eNOS、PI3K和Akt蛋白磷酸化水平及基因表達水平比L-NAME組均明顯上調(diào)。提示MHBFC增加MMVEC eNOS蛋白磷酸化和基因表達，與其增加eNOS-NO信號通路上游的MMVEC p-PI3K和p-Akt蛋白的表達及MMVEC PI3K、Akt mRNA表達有關。

綜上所述，MHBFC逆轉(zhuǎn)壓力超負荷心室重構(gòu)的調(diào)控機制可能是通過增加eNOS-NO信號通路上游MMVEC PI3K和Akt 蛋白磷酸化，以及增加MMVEC PI3K、Akt mRNA表達，進而增加MMVEC eNOS蛋白磷酸化及eNOS mRNA表達，激活eNOS-NO信號通路，從而對壓力超負荷引起的心肌損傷產(chǎn)生保護作用。激活eNOS-NO信號通路后，MHBFC具體如何發(fā)揮保護心肌損傷作用，還需進一步研究。