張晨紅，王建峰，陳華，李曉寧

(陜西省核工業(yè)215醫(yī)院，陜西咸陽(yáng)712000)

單純皰疹病毒(HSV)可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥，HSV-1通常引起單純皰疹病毒性腦炎(HSE)，HSV-2通常引起單純皰疹病毒性腦膜炎(HSM)[1]。HSE和HSM均表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，但HSE較HSM嚴(yán)重，如果治療不及時(shí)，往往會(huì)遺留永久后遺癥甚至急性期死亡。因此，及時(shí)鑒別HSE和HSM對(duì)于避免延誤治療和改善患者預(yù)后尤為重要。HSE和HSM中均發(fā)生CNS炎癥應(yīng)答，主要表現(xiàn)為腦脊液淋巴細(xì)胞增多和蛋白含量增加[2]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞移行到感染部位依賴于趨化因子[3]，趨化因子調(diào)控著白細(xì)胞的遷移，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4]。既往研究顯示，不同趨化因子在健康人群[5，6]、HSE[7]、蟲媒病毒性腦炎[8]和肺炎球菌腦膜炎[9]腦脊液中的水平不同，提示趨化因子在CNS炎癥過程中具有重要作用，但是目前尚缺乏趨化因子在鑒別HSE和HSM方面的相關(guān)報(bào)道。依據(jù)N端半胱氨酸殘基位置和數(shù)目，趨化因子分為4個(gè)亞族：CC亞族(28個(gè)成員，CCL1～CCL28)、CXC亞族(17個(gè)成員，CXCL1～CXCL17)、C亞族(2個(gè)成員，XCL1和XCL2)和CX3C亞族(惟一成員，CX3CL1)。本研究采用Bio-Plex懸液芯片技術(shù)，檢測(cè)HSE和HSM患者腦脊液和血清中30個(gè)趨化因子水平，分析HSE和HSM趨化因子水平的差異。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②具有CNS感染癥狀(如發(fā)熱、頭痛、頸強(qiáng)直、意識(shí)狀態(tài)改變、局灶性神經(jīng)癥狀或癲癇發(fā)作)；③HSE診斷標(biāo)準(zhǔn)采用國(guó)際共同聲明定義，即精神狀況改變(意識(shí)改變、昏睡、人格改變)持續(xù)時(shí)間>24 h，并具有下述表現(xiàn)中的至少3項(xiàng)：發(fā)病前72 h或發(fā)病后體溫≥38 ℃，癲癇發(fā)作，新發(fā)局灶性神經(jīng)缺損，腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥5×103/L，腦電圖異常[10]；同時(shí)患者入院時(shí)通過實(shí)時(shí)定量TaqMan PCR法檢測(cè)出HSV-1；④HSM診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)有腦膜刺激癥狀(頭痛、惡心或嘔吐、頸強(qiáng)直、腦膜刺激征陽(yáng)性)，MR或CT改變排除腦炎，入院時(shí)通過實(shí)時(shí)定量TaqMan PCR法檢測(cè)出HSV-2 DNA[1]；⑤排除合并其他病毒性腦炎或腦膜炎。選擇2013年6月～2016年5月我院收治的符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的HSE和HSM患者各20例。HSE組男9例、女11例，年齡28～73歲、中位年齡45.0歲； HSM組男4例、女16例，年齡29～61歲、中位年齡41.5歲。另外選擇20例存在頭痛，但腦脊液常規(guī)和生化正常、細(xì)菌和病毒陰性的患者作為對(duì)照組，排除感染、自身免疫性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病。對(duì)照組男10例、女10例，年齡23～66歲、中位年齡43.0歲。三組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者簽署知情同意書。

1.2 趨化因子檢測(cè)方法 受試者在癥狀出現(xiàn)后的20 d內(nèi)采集腦脊液和血清標(biāo)本，腦脊液標(biāo)本離心去除細(xì)胞，與血清標(biāo)本儲(chǔ)存于-70 ℃待測(cè)。采用Bio-Plex懸液芯片技術(shù)檢測(cè)腦脊液和血清中的30個(gè)趨化因子，即11個(gè)CXC亞族(CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL16)，18個(gè)CC亞族(CCL1、CCL2、CCL3、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27)和CX3CL1。試劑盒購(gòu)自Bio-Plex ProTM(Bio-Rad Laboratories)，按照說明書要求操作。通過Bio-Plex200系統(tǒng)測(cè)定，采取五參數(shù)Logistic標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算趨化因子水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件。因本研究各組樣本數(shù)<50，因此計(jì)量資料選擇Shapiro-Wilk檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)正態(tài)性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本研究全部數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，計(jì)量資料以中位數(shù)(M)表示。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。腦脊液和血清之間配對(duì)數(shù)據(jù)的比較采用Wilcoxon配對(duì)符號(hào)秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組腦脊液中趨化因子水平比較 見表1。對(duì)照組腦脊液中檢出CX3CL1和8個(gè)CXC亞族趨化因子(CXCL1、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL16)、5個(gè)CC亞族趨化因子(CCL1、CCL2、CCL15、CCL21和CCL25)。與對(duì)照組比較，HSE組腦脊液中有22個(gè)趨化因子水平增加，HSM組腦脊液中有25個(gè)趨化因子水平增加(P均<0.05)。與HSE組比較，HSM組腦脊液中CXCL5、CXCL8、CXCL11、CCL8、CCL13水平升高(P均<0.05)。

表1 三組腦脊液中趨化因子水平比較(pg/mL，M)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與HSE組比較，#P<0.05。

2.2 三組血清中趨化因子水平比較 見表2。對(duì)照組血清中檢出CX3CL1和全部11個(gè)CXC亞族趨化因子、全部18個(gè)CC亞族趨化因子。與對(duì)照組比較，HSE組血清中有7個(gè)趨化因子水平增加(P均<0.05)，HSM組血清中各趨化因子水平與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。全部趨化因子在HSE組和HSM組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 HSM和HSE組腦脊液與血清中趨化因子濃度的比較 考慮到可能存在著依賴趨化因子濃度梯度而導(dǎo)致細(xì)胞從血液向腦脊液遷移的情況，我們對(duì)HSE組和HSM組患者腦脊液和血清中水平升高的趨化因子進(jìn)一步分析，篩選腦脊液濃度/血清濃度>1的趨化因子。結(jié)果顯示，CXCL8、CXCL9和CXCL10在HSE和HSM組腦脊液中水平均升高，符合腦脊液濃度/血清濃度>1；CCL8和CXCL11僅在HSM組中腦脊液濃度/血清濃度>1，在HSE組中腦脊液/血清濃度均<1；其余趨化因子在HSM和HSE組中腦脊液/血清濃度均<1。

表2 三組血清中趨化因子水平比較(pg/mL，M]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

依據(jù)病毒血清型，HSV引起的CNS炎癥分為HSE、HSM兩類。HSE的發(fā)生率為2/1 000 000～4/1 000 000，發(fā)病無(wú)性別差異；HSM的發(fā)生率為20/1 000 000～40/1 000 000，男女比例約為1∶6[1，11]。HSV-1主要引起唇部皰疹，經(jīng)由三叉神經(jīng)或顳葉嗅神經(jīng)節(jié)擴(kuò)散到CNS繁殖。多數(shù)HSE患者核磁共振成像(MRI)可顯示上顳葉炎癥損害，臨床表現(xiàn)為高熱、頭痛、癲癇發(fā)作、定向力障礙和言語(yǔ)困難等癥狀。未進(jìn)行抗病毒治療的HSE患者病死率超過70%，往往導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)后遺癥。HSV-2通常引起生殖道黏膜感染，經(jīng)由骶神經(jīng)節(jié)傳播到CNS，HSM綜合征較HSE綜合征輕，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛頸強(qiáng)直、光過敏等。一般來(lái)說，HSE的臨床經(jīng)過較HSM嚴(yán)重，如果延誤診斷和治療，更容易發(fā)生急性期死亡和嚴(yán)重后遺癥。因此，尋找鑒別HSM和HSE的生物學(xué)標(biāo)記，對(duì)于減少臨床誤診、漏診，提高診斷準(zhǔn)確性并及時(shí)治療具有重要意義。

趨化因子具有趨化細(xì)胞的遷移、在免疫監(jiān)視中控制免疫細(xì)胞趨化、刺激炎癥細(xì)胞因子釋放等作用。既往研究顯示，單核細(xì)胞趨化因子CCL2、CX3CL1、CCL15、CCL20等在健康人CNS中表達(dá)[5,6]；我們?cè)诜荂NS感染對(duì)照人群的腦脊液中也發(fā)現(xiàn)了部分趨化因子。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)趨化因子在腦脊液水平超過了血清中的穩(wěn)態(tài)水平，與對(duì)照組比較，CXCL8、CXCL9、CXCL10在HSE和HSM患者腦脊液中均增加，而CCL8和CXCL11僅在HSM患者腦脊液中顯著增加。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌性腦膜炎患者腦脊液中CXCL8水平升高，同時(shí)伴隨著中性粒細(xì)胞增加，CXCL8的2個(gè)受體CXCR1和CXCR2表達(dá)于中性粒細(xì)胞表面，通過綁定而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的遷移。R?sler等[7]報(bào)道，HSE患者腦脊液中CXCL8水平升高，并且在病程中長(zhǎng)期穩(wěn)定存在。本研究結(jié)果顯示，HSE和HSM患者腦脊液中CXCL8水平高于血清，但是相比于HSE，在HSM腦脊液中的水平更高。

趨化因子受體CXCR3主要表達(dá)在CD4+和CD8+T細(xì)胞表面，可以與CXCL9、CXCL10、CXCL11結(jié)合，與CXCL11親和力最高[12]。CXCR3缺陷型小鼠對(duì)HSV-2的易感性增加，并且很快死亡[13]；但是在HSV-1感染小鼠，CXCR3缺陷卻對(duì)致命性CNS起到了保護(hù)作用[14]，提示CXCR3的作用或許依賴于小鼠的品系和組織特異性。與本研究結(jié)果相似，許多其他CNS炎癥腦脊液中CXCL9和CXCL10水平也升高[8]。但是，本研究發(fā)現(xiàn)CXCL11僅在HSM而不是HSE患者腦脊液中增多。其機(jī)制可能是HSM患者體內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞分泌大量IFN-γ進(jìn)入腦脊液，從而誘導(dǎo)CXCL11明顯增加。也可能存在其他機(jī)制，如CXCL10和CXCL11啟動(dòng)子包含IRSE元件，但是CXCL9啟動(dòng)子則沒有IRSE元件；STAT3-STAT1異源二聚體綁定到CXCL11啟動(dòng)子，但是STAT1-STAT2異源二聚體綁定到CXCL9和CXCL10啟動(dòng)子[12]。其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

CCL8參與Th2應(yīng)答，與淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞遷移相關(guān)，刺激嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，CCL8僅在HSM腦脊液中增加。此外，CCL8也高表達(dá)于肺炎球菌腦膜炎[9]，但是在產(chǎn)單核李斯特菌腦膜炎的腦脊液中是陰性的。關(guān)于CCL8的研究目前相對(duì)較少，其在HSM腦脊液中增高的意義仍有待進(jìn)一步充實(shí)。

總之，本研究顯示HSE和HSM腦脊液中趨化因子水平不同。盡管HSE病情較HSM更嚴(yán)重，但是HSM腦脊液中存在更多的趨化因子。CXCL8、CXCL9和CXCL10在HSE和HSM患者腦脊液中增多，但是僅HSM患者腦脊液中CCL8和CXCL11升高。推測(cè)CCL8和CXCL11可作為鑒別HSM和HSE的潛在指標(biāo)。