西南地區(qū)漢族人群慢性胰腺炎糜蛋白酶C基因突變分析

汪洋，嚴(yán)茂林，陳和平

(1電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院 四川省人民醫(yī)院，成都610072；2電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

慢性胰腺炎(CP)是胰腺長(zhǎng)期進(jìn)行性不可逆性炎性疾病，持續(xù)性胰腺炎癥會(huì)導(dǎo)致罹患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。CP的病因復(fù)雜，基因與環(huán)境相互作用在CP發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，與CP相關(guān)的易感基因和保護(hù)基因變異位點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，糜蛋白酶C(CTRC)基因已被證實(shí)為CP易感基因，該基因部分突變可以使酶分泌減少并降低其酶活性[1，2]，從而增加CP的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。CTRC基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)有大量新的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，這些SNP位點(diǎn)與CP發(fā)病有關(guān)。本研究旨在通過(guò)基因測(cè)序篩選西南地區(qū)漢族人群CTRC基因有意義的基因變異，從基因?qū)用嫔咸接慍P的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年10月～2018年2月在四川省人民醫(yī)院和崇州市人民醫(yī)院住院治療的漢族CP患者108例(CP組)，男62例、女46例，年齡(57.0±15.4)歲，吸煙35例、飲酒24例。均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)《慢性胰腺炎診治指南》[3]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除合并其他胰腺疾病(如胰腺癌、胰腺囊腫等)；高血壓、糖尿病等代謝性疾?。贿z傳性疾?。蛔陨砻庖咝约膊』颊?。另選取同期健康體檢的漢族人群150例作為對(duì)照組，男88例、女62例，年齡(60.0±16.9)歲，吸煙32例、飲酒28例。兩組性別、年齡、吸煙、飲酒情況具有可比性。本研究經(jīng)四川省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 CTRC基因檢測(cè)方法

1.2.1 DNA提取 采集受試者外周靜脈血4 mL，EDTA抗凝。采用DNA抽提試劑盒提取白細(xì)胞核DNA。利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度與純度，OD值檢測(cè)在1.6～1.8保證樣本達(dá)標(biāo)，校正樣本濃度為50 ng/μL，-20 ℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 在UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)檢索CTRC基因序列，截取外顯子及附近內(nèi)含子序列，使用Primer3.0在線(xiàn)設(shè)計(jì)引物，由上海生工公司進(jìn)行序列合成。稀釋保存于-20 ℃。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體積10 μL。反應(yīng)采用MyCycler Thermal Cycler擴(kuò)增儀。反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 5 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，DNA 1 μL，雙蒸水3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55～65 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，12 ℃保溫。取擴(kuò)增產(chǎn)物，采用2%瓊脂糖電泳，電壓120 V、時(shí)間20 min，獲取清晰特異的條帶，取對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序 使用純化酶將PCR產(chǎn)物純化后，用上述擴(kuò)增儀進(jìn)行純化程序和測(cè)序程序。純化體積10 μL。純化反應(yīng)體系：純化酶2 μL，PCR產(chǎn)物6 μL。純化條件：80 ℃15 min，37 ℃ 30 min，12 ℃保溫。測(cè)序體積10 μL。測(cè)序反應(yīng)體系：BigDye 0.3 μL，5×Buffer 2 μL，引物(正向或反向)0.33 μL，純化后的DNA 2 μL，雙蒸水5.37 μL。測(cè)序條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55～65 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共29個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，12 ℃保溫。反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行乙醇純化離心，避光晾干30 min，加入10 μL雙蒸水，使用ABI3130基因分析儀進(jìn)行測(cè)序，Chromas Lite Application軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，判定外顯子序列堿基是否有變化。

1.2.5 序列比對(duì)及預(yù)測(cè)分析 測(cè)序峰圖中不同顏色代表不同堿基，綠色表示脫氧腺嘌呤核苷酸，黑色表示脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷酸，紅色表示脫氧胸腺嘧啶核苷酸，藍(lán)色表示脫氧胞嘧啶核苷酸。單峰表示基因型為純合，雙峰表示基因型出現(xiàn)雜合。使用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的目的基因相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，確定判讀結(jié)果的可靠性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。使用Fisher確切概率檢驗(yàn)頻率變化。使用優(yōu)勢(shì)比(OR)和相應(yīng)95%置信區(qū)間(95%CI)表示遺傳模型和環(huán)境與CP的相關(guān)性。顯性模型為AB+AAvs.BB(A為最小等位基因，B為主要基因)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CTRC基因變異檢測(cè)結(jié)果 CP組CTRC基因第6外顯子檢測(cè)到1例c.611G>A雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第204位甘氨酸改變?yōu)楣劝彼?，預(yù)測(cè)突變性質(zhì)為可能致?。坏?外顯子檢測(cè)到1例c.703G>T雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第703位纈氨酸改變?yōu)楸奖彼?，預(yù)測(cè)突變性質(zhì)為可能致??；第7外顯子檢測(cè)到1例c.736C>T雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第736位精氨酸改變?yōu)榘腚装彼?，預(yù)測(cè)突變性質(zhì)為良性。對(duì)照組外顯子區(qū)域未檢出CTRC基因突變。另外發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNP位點(diǎn)，均為于內(nèi)含子區(qū)域，分別為第1內(nèi)含子的c.40+92T>A、c.40+133G>A，第5內(nèi)含子的c.493+49G>C、c.493+51C>A，第7內(nèi)含子的c.793-137A>G；CP組c.40+133G>A、c.493+49G>C位點(diǎn)發(fā)生頻率高于對(duì)照組(P<0.05或<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 兩組CTRC基因內(nèi)含子區(qū)域SNP位點(diǎn)發(fā)生情況比較[例(%)]

2.2 兩組CTRC基因SNP位點(diǎn)基因型頻率與等位基因頻率比較 經(jīng)上述統(tǒng)計(jì)分析篩選有意義的SNP位點(diǎn)，進(jìn)一步行基因型頻率和等位基因頻率比較。CP組與對(duì)照組c.40+133G>A位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較、c.493+49G>C位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。見(jiàn)表2、3。

表2 兩組CTRC基因SNP位點(diǎn)基因型頻率比較[例(%)]

表3 兩組CTRC基因SNP位點(diǎn)等位基因頻率比較[例(%)]

2.3 CTRC基因SNP遺傳模型與CP的關(guān)系 在顯性模型中,c.40+133G>A位點(diǎn)在兩組間的分布比較，CP組患病風(fēng)險(xiǎn)是對(duì)照組的1.088倍(P=0.030，95%CI為1.002～1.181)；c.493+49G>C位點(diǎn)在兩組間的分布比較，CP組患病風(fēng)險(xiǎn)是對(duì)照組的1.150倍(P=0.004，95%CI為1.038～1.275)。

2.4 CTRC基因SNP位點(diǎn)與吸煙、飲酒的關(guān)系 兩組飲酒者比較，c.40+133G>A位點(diǎn)和c.493+49G>C位點(diǎn)的分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；兩組吸煙者比較，c.493+49G>C位點(diǎn)分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=4.667，95%CI=1.341～16.239，P=0.014)。見(jiàn)表4、5。

表4 兩組吸煙者的CTRC基因SNP位點(diǎn)分布比較(例)

表5 兩組飲酒者的CTRC基因SNP位點(diǎn)分布比較(例)

3 討論

CP是一種由遺傳和環(huán)境因素共同作用所致的進(jìn)展性疾病，病因復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，CTRC基因的功能喪失性突變會(huì)增加CP患病風(fēng)險(xiǎn)[4～7]。Grabarczyk等[8]發(fā)現(xiàn)，SNP位點(diǎn)與CP有很強(qiáng)的相關(guān)性。CTRC基因位于染色體1p36.21上，長(zhǎng)度8.2 kb，包含8個(gè)外顯子。該基因編碼CTRC蛋白，非活化狀態(tài)的CTRC蛋白由16個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)肽、13個(gè)氨基酸的前肽(活化肽)和239個(gè)氨基酸的糜蛋白酶樣酶組成，活化后可以促進(jìn)胰蛋白酶原的自動(dòng)激活，降解胰蛋白酶和胰蛋白酶原，并輔助活化CPA1和CPA2[9]。與CP相關(guān)的CTRC基因突變目前共發(fā)現(xiàn)54個(gè)，包括26個(gè)錯(cuò)義突變、5個(gè)移碼突變、4個(gè)同義突變、一個(gè)框內(nèi)微突變及18個(gè)非編碼區(qū)的突變[10]，如主要發(fā)生在印度人的p.A73T和p.V235I突變以及主要發(fā)生在歐洲人種的p.R254W和p.K247_R254del突變[11，12]等。突變譜的不一致表明疾病的遺傳學(xué)病因與地域、人種等有關(guān)。此外CTRC基因的SNP改變也是CP發(fā)生的一個(gè)重要關(guān)聯(lián)因素。目前共發(fā)現(xiàn)3 209個(gè)CTRC基因SNP改變，包括rs121909294等致病性改變。Masson等[13]研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)常見(jiàn)的同義CTRC基因多態(tài)性c.285C>T和c.180C>T，且c.180C>T多態(tài)性位點(diǎn)與CP發(fā)生有相關(guān)性。目前CP中研究最多的SNP位點(diǎn)是c.180C>T。

本研究利用Sanger直接測(cè)序法，對(duì)CTRC基因進(jìn)行位點(diǎn)變異分析。結(jié)果顯示，CP組第6外顯子檢出1例c.611G>A雜合錯(cuò)義突變，外顯子7上分別檢出1例c.703G>T雜合錯(cuò)義突變和1例c.736C>T雜合錯(cuò)義突變，對(duì)照組未檢出上述突變。檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，c.611G>A和c.703G>T雜合錯(cuò)義突變未見(jiàn)報(bào)道。軟件預(yù)測(cè)突變c.611G>A和c.703G>T為致病性突變，c.736C>T突變?yōu)榉侵虏⌒酝蛔儭Ｉ镄畔W(xué)領(lǐng)域的預(yù)測(cè)尚需基礎(chǔ)的功能驗(yàn)證上述突變是否為致病性突變以及其具體的致病機(jī)制。此外還檢測(cè)到5個(gè)位于內(nèi)含子的SNP位點(diǎn)改變：c.40+133G>A、c.40+92T>A、c.493+49G>C、c.493+51C>A和c.793-137A>G。位點(diǎn)c.40+133G>A為新發(fā)現(xiàn)的SNP改變，未在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上找到相應(yīng)的rs號(hào)。CTRC基因c.40+133G>A和c.493+49G>C位點(diǎn)具有組間顯著差異。c.40+133G>A位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率在CP組分布高于對(duì)照組，在顯性模型下CP患病風(fēng)險(xiǎn)是對(duì)照組的1.088倍。c.493+49G>C位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率在CP組也顯著高于對(duì)照組，在顯性模型下CP患病的風(fēng)險(xiǎn)是對(duì)照組的1.150倍。表明CTRC基因c.40+133G>A和c.493+49G>C位點(diǎn)與中國(guó)西南漢族CP患者的發(fā)病可能存在一定關(guān)系，提示基因與疾病關(guān)聯(lián)的異質(zhì)性與種族和地區(qū)等因素有關(guān)。CP與吸煙和飲酒有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。LaRusch等[14]研究表明，伴有CTRC基因G60G位點(diǎn)單體型的吸煙者或酗酒者CP患病率更高。因此我們進(jìn)一步探討了SNP位點(diǎn)與吸煙和飲酒的關(guān)系。在吸煙因素存在的情況下，具有c.493+49G>C位點(diǎn)改變的CP患病風(fēng)險(xiǎn)是對(duì)照組的4.667倍。其機(jī)制可能是吸煙引起的應(yīng)激導(dǎo)致胰蛋白酶損傷而致病。多項(xiàng)研究表明c.180C>T位點(diǎn)與CP發(fā)病相關(guān)，但本研究未通過(guò)測(cè)序找到該SNP位點(diǎn)改變，其原因可能是樣本量小，未能驗(yàn)證到該位點(diǎn)與CP的關(guān)系；或該位點(diǎn)基因型存在人群和地域差異。

綜上所述，本研究豐富了西南地區(qū)CTRC基因位點(diǎn)改變數(shù)據(jù)，表明不同地域、種族間位點(diǎn)變異分布有差異性。雜合錯(cuò)義突變c.611G>A、c.703G>T和c.736C>T可能與西南地區(qū)漢族人群CP發(fā)病有關(guān)，SNP位點(diǎn)c.40+133G>A和c.493+49G>C可能是西南地區(qū)漢族人群CP易感位點(diǎn)，有位點(diǎn)c.493+49G>C改變的吸煙者可能有CP發(fā)病傾向。