徐滸東 嚴(yán)婷婷 艾羅燕 周 超 王 爭 湯佳音#

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所1(200001)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院胃腸外科2

背景：CBX3屬于異染色質(zhì)蛋白家族成員之一，近年研究發(fā)現(xiàn)CBX3與肺癌、骨肉瘤、胃癌等多種人類癌癥密切相關(guān)。目的：探討CBX3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義，并探索可能的作用機制。方法：選取2011年6月—2012年6月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院30例結(jié)直腸癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織。以實時定量PCR和免疫組化法分別檢測CBX3 mRNA和蛋白表達(dá)。將CBX3過表達(dá)質(zhì)粒和CBX3 siRNA轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO，以CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，蛋白質(zhì)印跡法檢測CBX3、p53蛋白表達(dá)。結(jié)果：結(jié)直腸癌組織中CBX3 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于相應(yīng)癌旁正常組織，且CBX3蛋白表達(dá)與腫瘤大小(P=0.025)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.013)和TNM分期(P=0.020)相關(guān)。過表達(dá)CBX3可有效上調(diào)RKO細(xì)胞中CBX3 mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時上調(diào)p53蛋白表達(dá)；敲低CBX3可有效下調(diào)CBX3 mRNA和蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，同時下調(diào)p53蛋白表達(dá)。結(jié)論：CBX3可能通過影響p53表達(dá)來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌疾病進(jìn)程，提示CBX3有望成為診斷和治療結(jié)直腸癌的新靶點。

結(jié)直腸癌是目前全球第三大常見的惡性腫瘤，2012年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例超過136萬，位居所有惡性腫瘤的第3位(其中男性位居第3位，女性位居第2位)，死亡人數(shù)超過69萬，位居第4位(其中男性位居第4位，女性位居第3位)[1]。隨著生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率也呈逐年上升的趨勢[2]。對2012年全國惡性腫瘤發(fā)病和死亡的分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌發(fā)病率位居第4位(其中男性位居第5位，女性位居第3位)，死亡率位居第5位(其中男性位居第5位，女性位居第4位)[3]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多種基因調(diào)控失常和信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，其機制一直是研究的熱點，對結(jié)直腸癌的治療和預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。

染色盒3(chromobox 3, CBX3)屬于異染色質(zhì)蛋白家族成員之一，其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域能在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶uv339H1的協(xié)助下識別甲基化組蛋白H3K9，從而調(diào)控基因的表達(dá)[4-6]。CBX3與甲基化H3K9結(jié)合能招募各種協(xié)同因子參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過程，包括端粒代謝、DNA損傷修復(fù)、RNA剪接、轉(zhuǎn)錄延伸、轉(zhuǎn)錄抑制和激活等[7-10]。近年研究發(fā)現(xiàn)CBX3與肺癌、舌癌、骨肉瘤、前列腺癌等多種人類癌癥密切相關(guān)[11-14]，但具體的分子機制目前尚不清楚。

p53是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高也是最重要的基因。野生型p53是一種抑癌基因，編碼的p53蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，可控制細(xì)胞周期的啟動，對細(xì)胞分裂起減慢或監(jiān)視的作用，如細(xì)胞受損而又未得到修復(fù)，p53將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-18]。

本研究通過檢測結(jié)直腸癌患者中CBX3表達(dá)，并以CBX3過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO(RKO為p53野生型細(xì)胞株)，檢測細(xì)胞增殖情況以及p53蛋白表達(dá)，旨在探討CBX3在結(jié)直腸癌中的可能作用機制，從而為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

一、研究對象

選取2011年6月—2012年6月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院30例結(jié)直腸癌患者，診斷經(jīng)術(shù)后病理檢查證實。同時選取距病變邊緣5 cm以上的癌旁組織作為對照。其中男17例，女13例；年齡31～90歲，平均67歲；腫瘤長徑<5 cm者12例，≥5 cm者18例；中-高分化5例，低分化25例；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期10例；浸潤局限于黏膜層或肌層者5例，漿膜或全層者25例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移2例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移28例。入選者住院前未接受過手術(shù)、放化療或免疫抑制劑治療。所有入選者均取得知情同意，本研究方案通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院倫理委員會的審批。

二、主要儀器和材料

實時熒光定量PCR儀(ABI公司)；RNAiso Plus總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-Time PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；CBX3特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(序列見表1)；人結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO(ATCC)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；CBX3 siRNA(由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建)(序 列見表1)；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑(美國Promega)；DharmaFECT 1轉(zhuǎn)染試劑(美國GE Healthcare)；CCK-8試劑盒(日本株式會社同仁化學(xué)研究所)；RIPA蛋白裂解液(美國Thermo Fisher Scientific)；CBX3抗體(美國Proteintech公司)、p53抗體(美國Santa Cruz公司)、GAPDH抗體(美國Cell Signaling Technology公司)、HRP標(biāo)記的IgG抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific)。

表1 CBX3序列

三、研究方法

1. 實時定量PCR法：取結(jié)腸組織充分研磨后裂解細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。行實時PCR，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。以2-△△Ct法計算樣本目的基因mRNA相對表達(dá)量，每組設(shè)立3個復(fù)孔。

2. 免疫組化染色法：將組織切片以3% H2O2處理15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；以PBS微波加熱修復(fù)抗原15 min后自然冷卻至室溫；滴加非免疫性羊血清，室溫封閉30 min；滴加CBX3抗體(工作濃度為1∶200)，4 ℃濕盒過夜后復(fù)溫 30 min，PBS漂洗3次；滴加HRP標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，自然晾干后中性樹膠封片。

結(jié)果判斷：光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞質(zhì)呈淡黃色或黃褐色顆粒定義為陽性細(xì)胞。采用Formwitz半定量積分法。于200倍視野下隨機觀察5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞，并觀察染色強度。陽性細(xì)胞率：≤5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。染色強度：無染色，0分；淡黃色，1分；黃色，2分；黃褐色，3分。兩項評分之積為染色總分：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。陰性和弱陽性為低表達(dá)，中等陽性和強陽性為高表達(dá)。采用雙盲法由兩名醫(yī)師獨立評分，不一致時取均值。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：將RKO細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以2×105個/孔的密度接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體操作步驟參照FuGENE HD和DharmaFECT 1轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)孵育24～72 h。

4. 細(xì)胞增殖實驗：RKO細(xì)胞按2 500個/孔的密度接種于96孔板上，每組設(shè)6個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后加入CCK-8試劑(以無血清培養(yǎng)基按照1∶10的體積比稀釋)。使用酶標(biāo)儀讀取450 nm波長處的吸光度(A)值，繪制細(xì)胞增殖圖。

5. 蛋白質(zhì)印跡法：RKO細(xì)胞轉(zhuǎn)染CBX3 siRNA 48～72 h后，收集細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌，加入蛋白裂解液裂解10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法定量蛋白濃度。取40 μg總蛋白上樣，行10% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至NC膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入CBX3、p53、GAPDH一抗(工作濃度分別為1∶1 000、1∶500、1∶2 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×5次，加入二抗(工作濃度1∶3 000)，常溫孵育1 h。計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、結(jié)直腸癌患者中CBX3表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

在30例結(jié)直腸癌患者中，實時定量PCR結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中CBX3 mRNA表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(P<0.001)(圖1A)，免疫組化結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中CBX3蛋白表達(dá)顯著高于相應(yīng)癌旁正常組織(P<0.001)(圖1B、圖2)。CBX3蛋白高表達(dá)與腫瘤大小(P=0.025)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.013)和TNM分期(P=0.020)相關(guān)，而與患者的性別、年齡、分化程度、浸潤深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)(表2)。

二、RKO細(xì)胞中CBX3 mRNA和蛋白表達(dá)

A：mRNA相對表達(dá)量(實時定量PCR法)；B：蛋白表達(dá)(免疫組化評分)

表2結(jié)直腸癌患者中CBX3蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

臨床病理例數(shù)CBX3表達(dá)高(n=15)低(n=15)P值性別 男171070.269 女1358年齡(歲) <6513580.269 ≥6517107腫瘤大小(cm) <512390.025 ≥518126分化程度 中-高分化5320.624 低分化251213浸潤深度 T1～T25230.624 T3～T4251312淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 N0228140.013 N1～N2871遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 M02814141.000 M1211TNM分期 Ⅰ～Ⅱ207130.020 Ⅲ～Ⅳ1082

實時定量PCR結(jié)果顯示，以質(zhì)粒過表達(dá)CBX3后，其mRNA表達(dá)顯著增高；以siRNA敲低CBX3后， 其mRNA表達(dá)顯著降低(圖3)。蛋白質(zhì)印跡法亦顯示過表達(dá)或敲低CBX3表達(dá)后，CBX3蛋白表達(dá)顯著增高或降低(圖4)。提示過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA可有效調(diào)控RKO細(xì)胞中CBX3 mRNA和蛋白表達(dá)。

1 Da=0.992 1 u

圖4過表達(dá)和敲低CBX3表達(dá)后RKO細(xì)胞中CBX3和p53蛋白表達(dá)變化(蛋白質(zhì)印跡法)

三、CBX3對RKO細(xì)胞增殖的影響

與對照組相比，過表達(dá)CBX3可促進(jìn)RKO細(xì)胞增殖，敲低CBX3表達(dá)可抑制RKO細(xì)胞增殖，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖5)。說明CBX3能影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力。

四、CBX3對p53表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染72 h后，過表達(dá)CBX3的RKO細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)較對照組顯著降低；敲低CBX3表達(dá)后，RKO細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)較對照組顯著升高(圖4)。說明CBX3對p53蛋白表達(dá)有一定的調(diào)控作用。

討 論

作為異染色質(zhì)蛋白家族成員，CBX3能結(jié)合基因啟動子區(qū)2甲基化或3甲基化的H3K9，從而起沉默基因的作用[19]。有文獻(xiàn)報道CBX3可負(fù)調(diào)控p53下游的p21基因，從而促進(jìn)腫瘤生長[20]。目前尚不清楚CBX3對p53是否具有調(diào)控作用。p53自1979年被首次報道以來，已被認(rèn)為是最重要的腫瘤抑制基因之一，對細(xì)胞生長、凋亡和 DNA 修復(fù)起調(diào)控作用[21]。但起初p53一度被認(rèn)為是癌基因，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在人類50%以上的腫瘤組織中均發(fā)生突變，突變后由于其空間構(gòu)象發(fā)生了改變，失去了應(yīng)有的抑癌功能，故由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗騕22-24]。有鑒于此，本研究選用RKO細(xì)胞株進(jìn)行實驗，其是p53野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株。

圖2 結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中CBX3蛋白表達(dá)(免疫組化染色，×200)

圖3 過表達(dá)和敲低CBX3表達(dá)后RKO細(xì)胞中CBX3 mRNA表達(dá)變化(實時定量PCR法)

圖5 過表達(dá)和敲低CBX3后RKO細(xì)胞增殖情況(CCK-8法)

本研究檢測了30例結(jié)直腸癌患者中CBX3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌組織中CBX3 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于癌旁正常組織，且蛋白表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(P<0.05)。提示CBX3表達(dá)可能與結(jié)直腸癌患者的惡性程度有關(guān)。但本研究樣本量偏少，可能存在一定的偏倚，未來需行大樣本、多中心臨床研究進(jìn)一步證實。此外，本研究未對結(jié)直腸癌患者的生存情況進(jìn)行隨訪，因此無法明確CBX3表達(dá)能否預(yù)測患者的預(yù)后以及是否能作為預(yù)測預(yù)后的獨立影響因素。本研究進(jìn)一步將CBX3過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO，發(fā)現(xiàn)其能明顯促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖能力，下調(diào)或上調(diào)p53蛋白表達(dá)，從細(xì)胞生物學(xué)的角度支持了CBX3表達(dá)與腫瘤大小等相關(guān)的臨床意義。但本課題尚未進(jìn)行動物實驗，無法明確體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境是否會對CBX3的作用產(chǎn)生一定的影響，仍需進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者CBX3表達(dá)水平升高，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起有一定的作用。CBX3發(fā)揮作用的機制可能是通過調(diào)控野生型p53表達(dá)而實現(xiàn)的，因此有望成為診斷和治療結(jié)直腸癌的新靶點。